Dicer1基因?qū)Υ笫笮募〖毎鸋9c2生物學特性的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、目的：
　　先天性心臟病(Congenital Heart Defect，CHD)是最常見的嬰幼兒先天畸形，發(fā)病率約為1％～2％，也是嬰幼兒非感染性疾病死亡的最主要原因。由于缺乏特異性早期診斷方法和治療策略相對單一且風險大，鑒定CHD相關易感基因并闡明其作用機理和調(diào)控機制，將具有重要的理論和實踐意義。
　　心臟發(fā)育依賴于不同類型細胞（如心肌細胞、心內(nèi)膜細胞、心臟神經(jīng)嵴細胞）的遷移、分化、增殖和凋亡，涉及各種轉錄因子、細胞黏附

2、分子、信號分子所構成的精確而復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。上述相關因素的改變將導致心臟異常發(fā)育而表現(xiàn)為CHD。
　　Dicer1基因定位于14q32.13，編碼一種具有1922個氨基酸殘基的核糖核酸酶。Dicer1酶能夠識別具有莖環(huán)結構的單鏈前體miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)或雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA），并將其切割成21～23nt的成熟miRNA或siRNA。Dicer1基因表

3、達異常與腫瘤、多發(fā)性硬化癥、突發(fā)性聽力喪失等疾病密切相關。Dicer1基因條件性敲除小鼠表現(xiàn)出心臟畸形，但關于Dicer1基因在心臟發(fā)育過程中的具體作用機理及其調(diào)控機制尚不清楚。
　　Nfatc3(Nuclear Factor of Activated T cells c3，Nfatc3)基因定位于16q22.2，編碼產(chǎn)物Nfatc3蛋白作為轉錄因子，可以與靶基因調(diào)控序列中Nfatc3結合位點（一致序列為-GGAAA-）結合，調(diào)控

4、靶基因的表達。動物實驗提示Nfatc3基因參與正常心臟發(fā)育過程。應用生物信息學軟件，我們在Dicer1基因啟動子區(qū)預測到轉錄因子Nfatc3結合位點。我們推測，Nfatc3基因可能調(diào)控Dicer1基因參與正常心臟發(fā)育。
　　因此，本研究首先通過檢測Dicer1-shRNA對大鼠心肌細胞H9c2生物學特性的影響，明確Dicer1基因表達降低導致心臟畸形的可能作用機理;其次通過染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunopreci

5、pitation，ChIP）、螢光素酶報告系統(tǒng)、RNA干擾（RNA interference，RNAi）等功能研究，闡明Nfatc3基因?qū)icer1基因的調(diào)控作用及其對大鼠心肌細胞H9c2生物學特性的影響，為揭示Dicer1基因及其調(diào)控基因Nfatc3在心臟發(fā)育過程中的作用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　1、細胞株
　　大鼠心肌細胞H9c2
　　2、組織標本
　　10例心肌組織標本

6、由中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院提供，標本采集均已簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審查批準通過。
　　二、實驗方法
　　1、Dicer1基因RNA干擾實驗
　　Dicer1-shRNA轉染大鼠心肌細胞H9c2，Real-time PCR和Western Blot檢測Dicer1基因表達。
　　2、Dicer1-shRNA對大鼠心肌細胞H9c2生物學特性的影響
　　CCK-8活細胞染色法檢測細胞增殖率，Western

7、 Blot分析PCNA表達水平;PI單染法測定細胞周期，Western Blot分析Cyclin E1和Cyclin A表達水平;AnnexinⅤ-APC/PI方法檢測細胞凋亡，Western Blot分析Caspase3表達水平。
　　3、Dicer1基因啟動子區(qū)Nfatc3結合位點的鑒定
　　生物信息學軟件預測Dicer1基因啟動子區(qū)Nfatc3結合位點，ChIP實驗鑒定Nfatc3與Dicer1基因啟動子區(qū)Nfatc3

8、結合位點的特異性結合;共轉染Nfatc3-siRNA和Dicer1基因啟動子區(qū)螢光素酶重組載體pDicer1，應用螢光素酶活性檢測系統(tǒng)分析螢光素酶活性，驗證Nfatc3與Dicer1基因啟動子區(qū)特異性結合。
　　4、心肌組織Nfatc3基因、Dicer1基因表達分析
　　在10例心肌組織中，Western Blot檢測Nfatc3蛋白表達，Real-time PCR檢測Dicer1 mRNA表達，并進行相關性分析。
　

9、　5、Nfatc3基因RNA干擾實驗
　　Nfatc3-siRNA轉染大鼠心肌細胞H9c2，Western Blot檢測Nfatc3蛋白表達，Real-time PCR和Western Blot分析Dicer1基因表達水平。
　　6、Nfatc3-siRNA對大鼠心肌細胞H9c2生物學特性的影響
　　CCK-8活細胞染色法檢測細胞增殖率，Western Blot分析PCNA表達水平;PI單染法測定細胞周期，Wester

10、n Blot分析Cyclin E1和Cyclin A表達水平;AnnexinⅤ-FITC/PI方法檢測細胞凋亡。
　　結果：
　　1、Dicer1-shRNA能夠有效抑制Dicer1基因表達
　　與轉染Negative control相比，轉染Dicer1-shRNA3d后，Dicer1基因mRNA和蛋白表達水平分別下降79％和54％(P＜0.05)。
　　2、Dicer1基因表達降低能夠抑制心肌細胞增殖

11、　　與轉染Negative Control相比，轉染Dicer1-shRNA3d后，活細胞數(shù)顯著減少，細胞增殖抑制率為31.86±0.02％，PCNA表達降低31％(P＜0.05)。
　　3、Dicer1基因表達降低使細胞周期重新分布，阻滯于S期
　　與轉染Negative Control相比，轉染Dicer1-shRNA4d后，G1期細胞數(shù)顯著減少，所占百分比為63.21±2.82％(P＜0.05)，而S期細胞數(shù)顯著增多，

12、所占百分比為21.22±6.0％，Cyclin E1表達升高35％，Cyclin A表達降低32％(P＜0.05)。
　　4、Dicer1基因表達降低能夠促進心肌細胞凋亡
　　與轉染Negative Control相比，轉染Dicer1-shRNA4d后，心肌細胞凋亡指數(shù)為13.04±3.0％，Caspase3表達升高16％(P＜0.05)。
　　5、Nfatc3能夠與Dicer1基因啟動子區(qū)Nfatc3結合位點特異性

13、結合
　　生物信息學軟件在Dicer1基因啟動子區(qū)預測到3個潛在的Nfatc3結合位點，ChIP實驗在體內(nèi)鑒定Nfatc3能夠與Dicer1基因啟動子區(qū)-476～-472bp處Nfatc3結合位點特異性結合;螢光素酶報告系統(tǒng)證明轉錄因子Nfatc3可與Dicer1基因啟動子區(qū)特異性結合并影響Dicer1基因轉錄活性。
　　6、心肌組織中Nfatc3基因與Dicer1基因表達呈正相關
　　Nfatc3蛋白和Dicer1

14、mRNA的表達呈顯著正相關(r=0.67，P＜0.05)。
　　7、Nfatc3基因正調(diào)控內(nèi)源性Dicer1基因表達
　　與轉染Negative control相比，轉染Nfatc3-siRNA2d后，Nfatc3蛋白表達水平下降73％(P＜0.05)，Dicer1基因mRNA和蛋白表達水平分別下降64％和49％（P＜0.05）。
　　8、Nfatc3基因表達降低能夠抑制心肌細胞增殖
　　與轉染Negative

15、control相比，轉染Nfatc3-siRNA3d后，細胞增殖抑制率為15.86±0.02％，PCNA表達降低29％(P＜0.05)。
　　9、Nfatc3基因表達降低使細胞周期重新分布，阻滯于S期
　　與轉染Negative control相比，轉染Nfatc3-siRNA3d后，G1期細胞數(shù)顯著減少，所占百分比為53.80±4.6％(P＜0.05)，而S期細胞數(shù)顯著增多，所占百分比為30.10±4.10％，Cyclin

16、 E1表達升高15％，Cyclin A表達降低21％(P＜0.05)。
　　10、Nfatc3基因表達降低不影響心肌細胞凋亡
　　與轉染Negative control相比，轉染Nfatc3-siRNA3d后，心肌細胞凋亡指數(shù)為0.37±0.12％(P＞0.05)。
　　結論：
　　1、Dicer1基因表達降低能夠促進心肌細胞凋亡，抑制心肌細胞增殖，使細胞周期重新分布、阻滯于S期。
　　2、Nfatc3基因