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文檔簡介
1、本文從以下幾方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
第一部分:BMP2對H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及組蛋白乙?;揎椀恼{(diào)控作用。
目的:
構(gòu)建BMP2過表達(dá)的心肌細(xì)胞模型,檢測BMP2對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5表達(dá)的影響,并研究BMP2對H9c2心肌細(xì)胞總組蛋白H3、基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;揎椉敖M蛋白乙?;?HATs)亞型p300和GCN5的調(diào)控作用,以證實(shí)我們的科學(xué)假設(shè):BMP2是
2、心肌細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的上游信號通路之一。
方法:
(1)過表達(dá)BMP2的腺病毒(AdBMP2)及對照空腺病毒(AdGFP)在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增后,分別以不同滴度轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細(xì)胞,24h后熒光倒置顯微鏡下觀察AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染效率。
(2) AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h、48
3、h和72h后收集細(xì)胞,提取mRNA,Real-Time qRT-PCR檢測各處理組細(xì)胞BMP2、MEF2C、GATA4和Tbx5及HATs亞型p300和GCN5的mRNA表達(dá)水平,篩選最佳干預(yù)時間。
(3) AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞48h后收集細(xì)胞,比色法檢測各處理組H9c2心肌細(xì)胞核蛋白HATs活性,Western-blotting檢測各處理組細(xì)胞總組蛋白H3的乙酰化水平,ChIP-Real-Tim
4、e qPCR檢測各處理組細(xì)胞MEF2C、GATA4和Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;?。
結(jié)果:
(1) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h后,熒光倒置顯微鏡下可見細(xì)胞中出現(xiàn)大量綠色熒光,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示AdBMP2轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上。
(2) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h、48h、72h后,BMP2及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和GATA4的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高(P<0
5、.05),并于轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到高峰,而Tbx5的表達(dá)沒有明顯變化。
(3) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞48h后,HATs亞型p300的mRNA表達(dá)水平較對照組升高(P<0.05),而GCN5的表達(dá)水平與對照組相比沒有明顯的變化。
(4) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞48h后,細(xì)胞核蛋白HATs活性較對照組明顯升高(P<0.05),總組蛋白H3乙?;揭草^對照組明顯上調(diào)(P<0.05),MEF2C、GATA
6、4啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;揭嘞鄳?yīng)升高(P<0.05),但Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;脚c對照組相比未見明顯變化。
結(jié)論:
(1) BMP2可上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞中心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和GATA4的表達(dá),而對Tbx5的表達(dá)沒有影響。
(2) BMP2可引起H9c2心肌細(xì)胞組蛋白H3高乙?;?,可能是H9c2心肌細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的上游信號通路之一。
(3) BMP2引起的H9c2心肌
7、細(xì)胞組蛋白H3高乙?;赡芘cHATs亞型p300有關(guān)。
(4) BMP2對MEF2C和GATA4啟動子區(qū)組蛋白H3乙酰化的促進(jìn)作用可能是BMP2引起MEF2C和GATA4表達(dá)上調(diào)的機(jī)制之一,而Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;词蹷MP2的影響可能是Tbx5的表達(dá)不受BMP2調(diào)控的原因之一。
第二部分:p300參與BMP2對H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及組蛋白乙?;揎椀恼{(diào)控作用。
目的:
8、使用HATs亞型p300的抑制劑姜黃素(Curcumin)來研究p300在BMP2致H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4和MEF2C高表達(dá)及組蛋白高乙酰化中的作用,以證實(shí)我們的科學(xué)假設(shè):p300參與BMP2對H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及組蛋白乙酰化修飾的調(diào)控作用。
方法:
(1) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞后,用不同濃度的p300 HAT活性抑制劑姜黃素(10μM,20μM,30μM,40μM)
9、處理細(xì)胞(6h,12h,24h,48h),比色法檢測各處理組細(xì)胞HATs活性,篩選姜黃素最佳處理濃度及時間。
(2) AdBMP2和/或姜黃素處理H9c2心肌細(xì)胞后,Real-Time qRT-PCR檢測各處理組細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5及HATs亞型p300和GCN5的表達(dá)水平,Western-blotting檢測各處理組細(xì)胞總組蛋白H3的乙酰化水平,ChIP-Real-Time qPCR檢測各處理
10、組細(xì)胞GATA4、MEF2C和Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙酰化水平。
結(jié)果:
(1)不同濃度(10μM,20μM,30μM,40μM)的姜黃素處理細(xì)胞24h后,H9c2心肌細(xì)胞的HATs活性明顯下降(P<0.05),并于40μM達(dá)到最低點(diǎn)。40μM姜黃素分別處理細(xì)胞6h,12h,24h,48h后,HATs活性于處理后12h達(dá)到最低點(diǎn)。
(2) AdBMP2和姜黃素共同處理H9c2心肌細(xì)胞后,心臟核心轉(zhuǎn)錄因子
11、GATA4和MEF2C及HATs亞型p300的mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)AdBMP2處理組明顯下降(P<0.05),而Tbx5及GCN5的mRNA表達(dá)水平在各處理組之間沒有明顯的變化。
(3) AdBMP2與姜黃素共同處理H9c2心肌細(xì)胞后,細(xì)胞中總組蛋白H3乙?;郊癎ATA4和MEF2C啟動子區(qū)組蛋白H3乙酰化水平較單獨(dú)AdBMP2處理組明顯下降(P<0.05),而Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙酰化在各處理組之間沒有明顯的變化
12、。
結(jié)論:
(1)姜黃素可抑制HATs亞型p300的表達(dá),而對GCN5的表達(dá)沒有影響。
(2)在H9c2心肌細(xì)胞中,p300 HAT活性抑制劑姜黃素可拮抗BMP2引起的組蛋白H3高乙?;癎ATA4和MEF2C的高表達(dá),說明p300參與BMP2對H9c2心肌細(xì)胞GATA4和MEF2C表達(dá)及組蛋白乙酰化的調(diào)控。
(3)在H9c2心肌細(xì)胞中,Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;捌浔磉_(dá)可能不受p300的調(diào)
13、控。
第三部分:BMPs參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙酰化作用。
目的:
使用BMPs信號通路抑制劑dorsomorphin(DM)來研究BMPs在氧化應(yīng)激反應(yīng)所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙?;械淖饔?,以證實(shí)我們的科學(xué)假設(shè):BMPs參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙?;?。
方法:
(1)不同濃度H2O2(50μM、100μM、150μM、200μM、
14、250μM、300μM、350μM、400μM)處理H9c2心肌細(xì)胞,24h后采用MTT法檢測各處理組細(xì)胞的存活率。
(2)5μM的BMPs信號通路抑制劑DM和/或適宜濃度的H2O2處理細(xì)胞,Real-Time qRT-PCR檢測各處理組細(xì)胞BMP2及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2C和Tbx5的表達(dá)水平,Western-blotting檢測各處理組細(xì)胞總組蛋白H3的乙?;?。
結(jié)果:
(1)50、1
15、00和150μM濃度的H2O2對H9c2心肌細(xì)胞的存活率沒有明顯的影響,200、250、300、350、400和450μM濃度的H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞后,細(xì)胞的存活率分別降低10.5%、16.9%、21.9%、32.4%、47.0%和58.6%。
(2)400μM H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞后,BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的mRNA表達(dá)水平較空白對照組明顯升高(P<0.05),細(xì)胞組蛋白H3的乙酰化水平亦
16、相應(yīng)升高(P<0.05)。
(3)400μM H2O2和DM共同處理H9c2心肌細(xì)胞后,H9c2心肌細(xì)胞中總組蛋白H3乙?;捷^單獨(dú)400μM H2O2處理組有所下降(P<0.05),GATA4和Tbx5的mRNA表達(dá)水平也較單獨(dú)400μM H2O2處理組有所降低(P<0.05),而MEF2C的mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)400μM H2O2處理組有所升高(P<0.05)。
結(jié)論:
(1)利用H2O2成功構(gòu)建H
17、9c2心肌細(xì)胞氧化損傷模型。
(2)400μM H2O2引起的氧化應(yīng)激可上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的表達(dá)并引起細(xì)胞組蛋白H3高乙?;?br> (3) BMPs信號通路抑制劑DM對400μM H2O2引起的氧化應(yīng)激所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白H3高乙?;癎ATA4和Tbx5表達(dá)上調(diào)具有一定的拮抗作用,說明BMPs(BMP2及其它BMPs亞型)參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞組蛋白高乙?;癎
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