游離脂肪酸誘導大鼠心肌細胞H9c2凋亡機制的初步探究.pdf

1、研究背景和研究目的:
　　代謝綜合征(metabolic Syndrome，MetS，MS)是一種代謝異常疾病，往往伴有肥胖、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病、血脂異常等現(xiàn)象，患有MS的病人較普通人具有較高的心血管患病率，研究發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸(Free fatt acids，F(xiàn)FAs)與MS有著密切聯(lián)系，機體內(nèi)過量的FFA往往和肥胖、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病、血脂異常等MS病征互為因果關(guān)系，其中FFA中的飽和脂肪酸(saturated fatt

2、y acids，SFA)，被認為是致病的主要因素。研究表明SFA中的棕櫚酸(Palmitic acid, PA)能夠誘導多種細胞發(fā)生凋亡，其中包括心肌細胞，然而PA誘導心肌細胞凋亡的具體分子機制目前還并不十分清楚。
　　β-Arrestin2蛋白作為arrestins家族的一員，除能夠參與7跨膜蛋白受體(seventransmembrane receptors，7TMRs)的脫敏、內(nèi)吞、泛素化降解外，還可作為多功能的支架和接頭蛋白

3、，廣泛的參與多種信號通路，其中包括多種細胞存活和凋亡相關(guān)信號通路，然而β-arrestin2對凋亡具體是促進還是抑制，需要根據(jù)β-arrestin2所激活的下游蛋白、以及細胞類型和實驗方式來確定。到目前為止，β-arrestin2是否參與PA誘導的心肌細胞凋亡過程仍未有研究。
　　Akt/GSK-3β信號途徑，對細胞的增值和凋亡具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，已有研究表明β-arrestin2能夠招募c-Src和Akt，促進Akt的磷酸化激活

4、，進而磷酸化GSK-3β的第九位絲氨酸位點，使GSK-3β活性下調(diào)，進而促進細胞增殖、抑制凋亡。然而在PA誘導的細胞凋亡中并不清楚是否存在此種調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　因此，為探討以上問題，我們以H9c2心肌細胞系作為細胞模型，用體外高濃度PA來模擬體內(nèi)高FFA環(huán)境，初步探究FFA誘導心肌細胞凋亡的分子機制，旨在探討β-arrestin2以及Akt/GSK-3β信號通路在FFA誘導心肌細胞凋亡中的作用及分子機制，為MS所引起的心臟疾病提供新

5、的分子機理解釋及潛在的理論治療靶點。
　　研究結(jié)果:
　　1、棕櫚酸(PA)能夠以濃度梯度和時間梯度依賴的方式誘導H9c2細胞發(fā)生凋亡。
　　為驗證PA對H9c2細胞的作用，我們首先通過SRB實驗，確定了PA對H9c2細胞的生長抑制作用，然后通過Hoechst33258對濃度梯度PA處理的H9c2細胞進行細胞核染色，初步確定PA能夠誘導H9c2細胞發(fā)生凋亡，最后通過流式細胞技術(shù)和Western Blot確定了PA能夠以

6、濃度梯度和時間梯度依賴的方式誘導H9c2細胞發(fā)生凋亡。
　　2、在PA誘導的H9c2細胞凋亡中，β-arrestin2可能起著抑制細胞凋亡的作用，確定的結(jié)論仍需要進一步的實驗驗證。
　　為研究β-arrestin2在PA誘導的H9c2細胞凋亡中的作用，我們通過WesternBlot實驗發(fā)現(xiàn)，PA同樣能以濃度梯度和時間梯度依賴的方式下調(diào)β-arrestin2的含量，并且β-arrestin2含量與凋亡指標呈負相關(guān)，初步猜測β-

7、arrestin2在PA誘導的H9c2細胞凋亡過程中起著抑制細胞凋亡的作用，而過表達外源β-arrestin2反而促進了PA誘導的細胞凋亡，免疫熒光顯示外源性β-arrestin2在細胞中的分布與內(nèi)源β-arrestin2并不一致，因此過表達外源β-arrestin2引起的促進凋亡的結(jié)果可能并不可信。
　　3、抑制GSK-3β能夠顯著的抑制PA誘導的H9c2的細胞凋亡。
　　在PA誘導H9c2細胞凋亡中，Western Bl

8、ot結(jié)果顯示，p-Akt(Ser473)水平顯著下調(diào)，而p-GSK-3β(ser9)并無明顯變化。GSK-3β的抑制劑LiCl實驗顯著的抑制了PA誘導的H9c2細胞凋亡。說明GSK-3β在PA誘導H9c2中的促凋亡作用，進一步的GSK-3β干擾實驗同樣顯著的抑制了PA誘導的H9c2細胞的凋亡，再次確定了GSK-3β在PA誘導H9c2凋亡中的促進作用。
　　結(jié)論:
　　1、PA能夠以濃度梯度和時間梯度依賴的方式誘導H9c2細胞