艾塞那肽對(duì)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：2-NBDG用于H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取的能力研究
　　目的：評(píng)估熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diaxol-4-y1)amino]-2-deoxyglucose，2-NBDG)作為光學(xué)探針檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取的能力。
　　方法：間接免疫熒光法測(cè)定H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT-1、GLUT-4)的表達(dá)；熒光酶標(biāo)儀測(cè)定2-NBDG孵育H9c2細(xì)胞

2、的最適濃度和時(shí)間。以2-NBDG最適濃度孵育H9c2心肌細(xì)胞，同時(shí)用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度差異，觀察心肌細(xì)胞攝取2-NBDG情況。
　　結(jié)果：
　　(1)：接免疫熒光法顯示H9c2心肌細(xì)胞表達(dá)GLUT-1、GLUT-4。
　　(2)：2-NBDG孵育H9c2心肌細(xì)胞的最適濃度為100μmol/L和最適時(shí)間為30min。共聚焦成像和流式細(xì)胞儀均顯示H9c2心肌細(xì)胞能有效攝取2-NBDG：激光共聚焦掃描

3、成像顯示2-NBDG組細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)(93.32±7.60)，2-NBDG+D-Glu組H9c2細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)表達(dá)(68.51±3.56)，但較單純2-NBDG組熒光信號(hào)減弱27％(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)2-NBDG組熒光強(qiáng)度為51.17±5.09；2-NBDG+D-Glu組熒光強(qiáng)度為27.27±2.48較單純2-NBDG組降低46.7％(P<0.01)。
　　(3)：采用2-NBDG檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖攝取的方法，證實(shí)胰島素能

4、促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖的攝取。
　　結(jié)論：2-NBDG能迅速被表達(dá)GLUT-1、GLUT-4的H9c2心肌細(xì)胞攝取，且被D-Glu競(jìng)爭(zhēng)性抑制，表明2-NBDG可作為一個(gè)方便且敏感的探針，用于檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖攝取的能力。
　　第二部分：Exendin-4對(duì)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
　　目的：探索艾塞那肽(Exendin-4，EX-4)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響及其與p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系。

5、　　方法：用不同濃度EX-4和不同孵育時(shí)間處理H9c2心肌細(xì)胞，探討其時(shí)效-量效關(guān)系，確定EX-4處理H9c2細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間，以EX-4最適濃度孵育H9c2心肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組：正常對(duì)照組(NC組)，EX-4處理組(EX-4組)，EX-4+p38α/β/γ/δMAPK通路抑制劑BIRB796處理組(BIRB796組)，胰島素處理對(duì)照組(Insulin組)，熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取能力

6、，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)強(qiáng)度差異，測(cè)出心肌細(xì)胞葡萄糖攝取變化。間接免疫熒光法檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞GLP-1受體(GLP-1R)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)：H9c2心肌細(xì)胞膜上表達(dá)GLP-1受體；
　　(2)：EX-4處理H9c2心肌細(xì)胞的最適濃度和時(shí)間分別為200μmol/L和45min。
　　(3)：熒光酶標(biāo)儀結(jié)果示：對(duì)照組熒光強(qiáng)度為369.78±59.69，EX-4組熒光強(qiáng)度為48

7、7.96±66.44，Insulin組熒光強(qiáng)度為458.09±26.41，EX-4組和Insulin組與對(duì)照組相比均促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞葡萄糖攝取，分別增加24.2％和19，3％(p<0.05)。
　　(4)：流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：2-NBDG對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度為71.13±12.83，EX-4組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度為119.77±15.32，BIRB79組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度為90.75±4.08，EX-4組較對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加40.