Lgr5在細(xì)胞重編程中作用和機(jī)制的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.確定成體干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr5對(duì)細(xì)胞重編程的作用。
　　2. LGR5作為G蛋白偶聯(lián)受體，是否存在合適配體參與影響細(xì)胞重編程。
　　3.探究LGR5影響細(xì)胞重編程的機(jī)制。
　　4.利用LGR5對(duì)細(xì)胞重編程的影響解決生物醫(yī)學(xué)難題。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　首先采用qPCR的技術(shù)手段，檢測(cè)Lgr5在小鼠各個(gè)組織細(xì)胞中的表達(dá)情況，根據(jù)表達(dá)情況構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體或者敲低表達(dá)載體，過(guò)表達(dá)載體我們選擇構(gòu)

2、建在可以被強(qiáng)力霉素（Doxycycline，Dox）控制表達(dá)的pFUW-tet-on載體上，利用293T細(xì)胞以及psPAX2和pmd2.G的病毒包裝質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)病毒的包裝和獲得，利用病毒感染的方式，直接感染小鼠胚胎多能性干細(xì)胞或者建立Lgr5過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)小鼠胚胎多功能干細(xì)胞細(xì)胞株，在此基礎(chǔ)上探測(cè)Lgr5過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠胚胎多能干細(xì)胞的影響，同樣Lgr5的敲低表達(dá)載體按照同樣的方法。對(duì)于小鼠胚胎多能干細(xì)胞的影響，我們主要通過(guò)觀察細(xì)胞物理形態(tài)和檢測(cè)

3、多能干細(xì)胞的多能標(biāo)記基因（marker）Nanog、Oct4、Rex1、Fgf5等。針對(duì)Lgr5對(duì)細(xì)胞重編程的影響，我們利用小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞作為體細(xì)胞重編程的起始細(xì)胞，利用已經(jīng)成功建立的誘導(dǎo)體系，獲得能夠直接添加強(qiáng)力霉素啟動(dòng)內(nèi)源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生重編程的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，利用病毒感染的方法完成對(duì)此細(xì)胞Lgr5的過(guò)表達(dá)或者敲低，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞重編程，對(duì)重編程得到的克隆的形成的速率和效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比

4、較，密切觀察記錄細(xì)胞出現(xiàn)克隆的日期。為了探究Lgr5影響細(xì)胞重編程的機(jī)制，我們篩選了跟Lgr5相關(guān)的一些蛋白。LGR5作為G蛋白耦聯(lián)受體，參與Wnt信號(hào)通路，而Wnt信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞干性維持有重要作用，RSPO3作為L(zhǎng)GR5的同源配體，與其共同作用參與Wnt信號(hào)通路，同樣方法檢測(cè)Rspo3過(guò)表達(dá)對(duì)于重編程效率和小鼠胚胎多能干細(xì)胞的影響。利用熒光定量PCR和Western Blot在RNA水平和蛋白水平檢測(cè)Wnt通路中核心因子β-cate

5、nin的相關(guān)變化。利用ChIP-seq深度解析不同類(lèi)型細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列，分析LGR5和RSPO3參與Wnt通路調(diào)控的下游靶基因，揭示Lgr5在細(xì)胞重編程中的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. Rspo3過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的重編程效率。
　　2. Lgr5和 Rspo3在小鼠胚胎干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后能夠上調(diào)胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)記基因的表達(dá)。
　　3.在小鼠胚胎干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Lgr5基因，