豬Lgr5基因克隆及其對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、Lgr5（Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor5）是腸上皮干細(xì)胞（IESCs）的標(biāo)記基因，它標(biāo)記的是隱窩基底柱狀（CBC）細(xì)胞。為了研究豬Lgr5對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖的影響，本試驗(yàn)通過(guò)克隆豬 Lgr5基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)了其結(jié)構(gòu)與功能；通過(guò)構(gòu)建Lgr5-pcDNA3.1+載體，獲取Lgr5過(guò)表達(dá)的IPEC-J2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法檢測(cè)Lg

2、r5過(guò)表達(dá)后對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。利用 Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑Wnt3a處理對(duì)照組細(xì)胞和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939處理Lgr5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞后，分別檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖與Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響，解析豬Lgr5促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制。為開(kāi)展Lgr5標(biāo)記的豬腸上皮干細(xì)胞研

3、究奠定基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）豬Lgr5 cDNA的克隆。運(yùn)用3'RACE（RACE）、同源性克隆和重疊PCR的方法，克隆獲得了豬Lgr5cDNA序列，全長(zhǎng)2824bp，其中編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)2724 bp，3'非編碼區(qū)（UTR）長(zhǎng)108 bp。
　?。?）豬Lgr5的生物信息學(xué)分析。豬Lgr5蛋白經(jīng)預(yù)測(cè)為膜蛋白，含有信號(hào)肽和7次α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)，與人Lgr5蛋白氨基酸序列的同源性高達(dá)90.30％；進(jìn)化樹(shù)分

4、析發(fā)現(xiàn)豬Lgr5蛋白是一個(gè)種保守性蛋白。
　?。?）Lgr5在IPEC-J2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的鑒定。構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體 Lgr5-pcDNA3.1+，并獲得穩(wěn)定表達(dá) Lgr5的IPEC-J2細(xì)胞株。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在接種72 h，Lgr5過(guò)表達(dá)組Lgr5mRNA豐度和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。
　　（4）Lgr5過(guò)表達(dá)促進(jìn)IPEC-J2細(xì)胞增殖。細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)

5、照組相比，Lgr5過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞在接種48 h后增殖能力顯著提高。
　　（5）Lgr5過(guò)表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。收集細(xì)胞生長(zhǎng)72h的細(xì)胞樣品。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Lgr5過(guò)表達(dá)組Axin2、GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著降低，β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　?。?）Lgr5激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)IPEC-J2細(xì)胞

6、增殖。Wnt3a組細(xì)胞增殖能力在Wnt3a處理48 h顯著高于對(duì)照組；與對(duì)照組相比，在Wnt3a處理48 h，Wnt3a組的Axin2和GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著降低，β-catenin、c-Myc、cyclin D1和Lgr5蛋白表達(dá)水平顯著升高；XAV939組細(xì)胞增殖能力在XAV939處理24 h和48 h后顯著低于Lgr5過(guò)表達(dá)組；與Lgr5過(guò)表達(dá)組相比，在XAV939處理48 h，XAV939組的Axin2和GSK-3β蛋白表