LGR5在肝癌細(xì)胞,肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、肝癌是我國臨床中一種常見的惡性腫瘤疾病，經(jīng)統(tǒng)計顯示其死亡率很高。研究結(jié)果顯示，乙型、丙型等肝炎病毒是肝癌疾病的主要發(fā)病因素，提示肝臟炎癥與肝癌疾病的發(fā)病有密切關(guān)系。此外，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的相關(guān)研究中可以發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路除了在干細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用以外，還與肝癌的發(fā)生發(fā)展等過程有著一定的聯(lián)系。在生物進化過程中的眾多通路中,Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路極為保守，也保持了高度的同源性。大量研究顯示，在動物

2、胚胎的發(fā)育過程中，此通路還參與了多個不同的領(lǐng)域。此外，在肝臟組織的生長和更新過程中，Wnt/β-catenin信號通路也起著調(diào)控的關(guān)鍵性作用。上世紀(jì)八十年代，科研人員才發(fā)現(xiàn)了Wnt/β-catenin信號和腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的聯(lián)系。而關(guān)于Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝癌疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用越來越受到密切的關(guān)注，目前研究發(fā)現(xiàn)，通過對下游靶基因的激活，Wnt/β-catenin信號通路可導(dǎo)致肝癌疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程。因

3、此，近些年來在Wnt/β-catenin信號通路方面的針對性治療逐漸成為研究的新熱點。
　　與cyclinDl、c-myc等基因一樣，LGR5也是一種受到Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的靶基因。大量研究結(jié)果提示，LGR5在不同的腫瘤疾病(肝細(xì)胞癌，結(jié)腸癌，卵巢癌，皮膚基底細(xì)胞癌)中的表達(dá)水平均有不同程度的升高。富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine rich repeat containing G protein coupl

4、ed receptor5，LGR5)首先從結(jié)直腸癌細(xì)胞中分離出來。近些年來,研究者在肝癌及卵巢癌等細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了LGR5基因的表達(dá),實驗結(jié)果證實：LGR5基因是Wnt信號傳導(dǎo)途徑的靶基因。荷蘭研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LGR5僅僅在人體的小腸、結(jié)腸隱窩基底柱狀上皮細(xì)胞呈特異性的表達(dá),此基因編碼產(chǎn)物為陽性的細(xì)胞具有干細(xì)胞的各種生物學(xué)活性,且還證實了LGR5是小腸、結(jié)直腸干細(xì)胞的標(biāo)記物,因此推測認(rèn)為：LGR5可能是多種不同腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。目前的相關(guān)

5、臨床研究資料也顯示，有部分患有肝細(xì)胞癌的病人，其LGR5的過度表達(dá)現(xiàn)象和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最關(guān)鍵的效應(yīng)物基因(β-catenin)的第3外顯子發(fā)生突變現(xiàn)象之間的關(guān)系十分密切。
　　因此本課題進行了以下幾個方面的研究：1. LGR5啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建；2. LGR5在各種肝癌細(xì)胞中表達(dá)情況；3.LGR5在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況。通過上述實驗旨在證實，Wnt信號通路出現(xiàn)異常激活現(xiàn)象后可以明顯上調(diào)LGR5的表達(dá)水平，推測Wnt

6、信號通路對肝細(xì)胞的異常增殖現(xiàn)象和肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，有望成為肝細(xì)胞癌疾病的一個新的治療靶點。
　　實驗方法：
　　1、LGR5啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建：采用PCR方法擴增LGR5啟動子不同長度片段，回收目的片段將其插入pGL4.21載體中，構(gòu)建了7個不同長度的報告基因質(zhì)粒，然后分別轉(zhuǎn)染到SW480和HCT116細(xì)胞中，并進行啟動子活性檢測和活性調(diào)節(jié)的研究；
　　2、LGR5在各種肝癌細(xì)胞中表達(dá)情況：

7、成功培養(yǎng)4種肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B、Huh7和PLC)和正常肝臟細(xì)胞L02，采用western-blot、Real-time PCR等方法檢測LGR5在4種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；
　　3、LGR5在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況：采用免疫組織化學(xué)方法檢測36例肝癌及其癌旁組織樣本，觀察LGR5在肝癌組織和癌旁組織中的陽性率表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)鑒定，7種LGR5啟動子質(zhì)粒均構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進

8、行檢測，LGR5啟動子F1-F6在SW480和HCT116細(xì)胞中，均有很高的活性，并且在HCT116中活性更高。F7與其余各組相比活性明顯降低，說明-645～-330之間為啟動子活性關(guān)鍵區(qū)域。此外還發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)AC133或β-Catenin后F1活性增強，在SW480和HCT116細(xì)胞中變化趨勢一致，且在HCT116細(xì)胞中變化更明顯。
　　2、LGR5在肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，與正常肝臟細(xì)胞L02(L02:1.2±0.10)相比較，LG

9、R5蛋白在四種肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平依次為(HepG2=0.7±0.04，Hep3B=0.4±0.03，Huh7=0.12±0.07，PLC=0.3±0.04)，均明顯出現(xiàn)下調(diào)(P＜0.01)。在huh7細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。但是與其它三種肝癌細(xì)胞株相比，HepG2細(xì)胞株中LGR5蛋白的表達(dá)稍高。與正常肝臟細(xì)胞L02相比，四種肝癌細(xì)胞的LGR5 mRNA表達(dá)水平依次為（ HepG2/L02=0.3±0.04，Hep3B/L02=0.08±0.0

10、3，Huh7/L02=0.02±0.01，PLC/L02=0.1±0.04），均明顯下調(diào)(P＜0.01)，此結(jié)果與Western blot檢測結(jié)果相一致。其中Huh7細(xì)胞下調(diào)最為明顯，達(dá)到20倍(P＜0.01)。
　　3、與肝癌癌旁組織相比較，LGR5在肝癌組織的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢,其中36例肝癌組織樣本中，陽性表達(dá)僅6例(16.7％),陰性表達(dá)30例(83.3％)；而在肝癌癌旁組織中，陽性表達(dá)27例(75.0％)，陰性表

11、達(dá)僅9例(25.0％)，癌組織中LGR5陽性表達(dá)例數(shù)較癌旁組織明顯減少(P＜0.01)。在陽性病例中，LGR5主要分布在細(xì)胞漿及胞膜中，極少分布在細(xì)胞核中。
　　結(jié)論：
　　通過上述實驗結(jié)果可知，CD133或β-Catenin可在啟動子水平方面明顯上調(diào)LGR5的表達(dá)水平，LGR5是一種Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶基因，在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)激活現(xiàn)象以后，可以引起LGR5表達(dá)水平的下調(diào)或上調(diào)，可能對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化現(xiàn)象，以及腫