用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及生物應(yīng)用.pdf

1、在生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生多種自由基，它們對維持生物體正常生理功能發(fā)揮重要作用，同時自由基含量的變化與機(jī)體衰老和疾病發(fā)生又有著緊密聯(lián)系，當(dāng)其含量激增時可破壞體內(nèi)代謝平衡，導(dǎo)致生理功能紊亂。臭氧(O3)是活性氧自由基(ROS)的一種，平流層中的臭氧阻止了大量的太陽紫外線，對流層中的臭氧則在危害著生物圈的安全。臭氧作為對體內(nèi)炎癥和外界刺激的響應(yīng)還可以內(nèi)源性產(chǎn)生，通過誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜的改變、破壞離子通道、改變酶的活性等誘導(dǎo)細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致多種疾

2、病如皮膚癌、呼吸道疾病等。目前用于檢測O3的方法較少，包括化學(xué)發(fā)光法(CL)、電化學(xué)方法(EL)、熒光法等，由于檢測靈敏度低、選擇性差和反應(yīng)時間長等使得對臭氧的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如其他活性氧。臭氧在細(xì)胞內(nèi)的生理功能、參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、與疾病的關(guān)系等仍不明確，因此發(fā)展適合生物體系臭氧檢測的方法具有重要研究意義。
　　熒光探針與活細(xì)胞內(nèi)自由基作用時可發(fā)生熒光強(qiáng)度或吸收波長位置變化，借助于激光共聚焦成像技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)活性小分子的“可視化

3、”檢測，從而對它們在生物體內(nèi)的動態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控。
　　以近紅外熒光團(tuán)花菁(Cy)為母體，以L-色氨酸(L-Trp)為識別基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一種近紅外O3檢測熒光探針(Trp-Cy)。
　　在化學(xué)體系中對探針與O3的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。Trp-Cy對H2O2(120μM)、NaClO(24μM)、·OH、t-BuOOH(30μM)、GSH和VC(300μM)的響應(yīng)很低，對O3的檢測無干擾；Trp-Cy能與O3迅速反應(yīng)，熒光強(qiáng)度

4、明顯增強(qiáng)并達(dá)到最大值且保持相對穩(wěn)定；探針熒光強(qiáng)度隨著加入O3濃度的增加明顯增強(qiáng)。O3濃度為1.0×10-6~7.0×10-6 M，表明Trp-Cy能檢測臭氧濃度的微弱變化。
　　通過MTT試驗(yàn)研究探針對細(xì)胞體系的影響，當(dāng)細(xì)胞50％存活時探針濃度為465μM，表明 Trp-Cy對細(xì)胞是低毒性的。采用激光共聚焦顯微成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了肺癌細(xì)胞 A549內(nèi)O3的實(shí)時檢測。
　　綜上所述，探針Trp-Cy具有以下特點(diǎn):⑴激發(fā)和發(fā)射位于近

5、紅外區(qū)(分別為630 nm、770 nm)，有效地避免了細(xì)胞內(nèi)自身熒光的干擾，減少了對細(xì)胞的損傷；⑵具有較大的斯托克斯位移(達(dá)140 nm)，有效地避免了探針的自猝滅，提高了檢測靈敏度及準(zhǔn)確性；⑶能與O3迅速反應(yīng)，不受共存的其他活性分子或金屬離子的干擾，有利于實(shí)時檢測細(xì)胞內(nèi)O3的微小變化；⑷探針自身熒光較弱，與O3結(jié)合后熒光顯著增強(qiáng)；⑸能特異性靶向線粒體。
　　該探針靈敏度高、反應(yīng)迅速、毒性低的特點(diǎn)在O3對生物體系影響的研究中具有