低氧狀態(tài)下水通道蛋白1參與細胞內(nèi)活性氧自由基的轉(zhuǎn)運及調(diào)節(jié)機制.pdf

1、目的：探討低氧狀態(tài)下水通道蛋白1(Aquaporin1，AQP1)是否參與活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的轉(zhuǎn)運。探討化學性低氧刺激下AQP1是否存在谷胱甘肽化修飾以及AQP1與ROS之間的關(guān)系。
　　方法：⑴構(gòu)建AQP1過表達細胞株:通過慢病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)，轉(zhuǎn)入帶有AQP1的基因序列的質(zhì)粒，建立穩(wěn)定過

2、表達AQP1的細胞株。⑵細胞低氧:AQP1過表達細胞與HUVEC正常細胞在96孔板中進行培養(yǎng)，待細胞80％-90％融合后更換培養(yǎng)基，在三氣孵育箱（設置參數(shù)為:1％O2、5％CO2、94％N2）中分別按0、2、4、6小時進行低氧處理。⑶活性氧檢測:低氧處理后細胞使用DCFH-DA探針孵育30min，洗去未進入細胞的DCFH，通過酶標儀在激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長525nm條件下檢測各組細胞的OD值。⑷30μM碘乙酰胺處理Balb/3T3

3、成纖維細胞4小時。⑸免疫沉淀:裂解細胞后提取細胞內(nèi)蛋白，通過蛋白A—瓊脂糖珠連接抗體—抗原，純化細胞內(nèi)AQP1。⑹western blot:使用抗谷胱甘肽抗體或AQP1抗體檢測免疫沉淀得到的蛋白樣品。
　　結(jié)果：①在熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染細胞的結(jié)果，與AQP1基因結(jié)合的GFP在細胞內(nèi)呈綠色熒光，如圖中所示，其余未轉(zhuǎn)入AQP1基因序列的在圖中呈黑色區(qū)域，圖中大部分細胞發(fā)出綠色熒光，表明AQP1的基因序列成功導入宿主細胞。②無論是

4、在生理狀態(tài)還是低氧刺激下，AQP1過表達HUVEC與正常HUVEC其內(nèi)活性氧濃度存在差異，2小時處我們發(fā)現(xiàn)AQP1過表達組細胞較HUVEC正常細胞ROS濃度低，但結(jié)果不具有統(tǒng)計學差異(P2=0.306)。而6小時處兩組細胞間結(jié)果沒有差異(P6=0.664)。③通過非還原SDS-PAGE于35Kd處沉淀所得AQP1，在同一位置處出現(xiàn)GSH條帶，且與陰性對照有明顯差別。
　　結(jié)論：水通道蛋白1無論是在生理狀態(tài)下還是細胞處于氧化應激時，