用于測(cè)定生物體內(nèi)活性物質(zhì)（自由基、金屬離子等）的熒光探針的合成及分析應(yīng)用.pdf

1、隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展與各種物理、化學(xué)、生物學(xué)的研究手段的應(yīng)用使生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程逐漸得到闡明.但是與此同時(shí)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在試管里研究得到的結(jié)果未必就完全反映了活體內(nèi)的情況.因此,要真正了解生命,必須了解生物各種活性物質(zhì)的實(shí)時(shí)變化. 目前,用于檢測(cè)生物體內(nèi)活性物質(zhì)的方法有多種,如原子吸收光譜法,NMR.光譜法,Electron probe microanalysis法等但它們的應(yīng)用存在一些不足:(1)需要具有揮

2、發(fā)性的樣品;(2)應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)時(shí)需要較大量的細(xì)胞;(3)只能檢測(cè)生物體系內(nèi)的活性物質(zhì)總量,從而導(dǎo)致其對(duì)目標(biāo)被測(cè)物的選擇性不高,或者雖能分別測(cè)定但卻不能描述其在細(xì)胞中的分布(4)不能描述被測(cè)物在細(xì)胞內(nèi)外的動(dòng)態(tài)變化.至今為止人們尚無(wú)法直接動(dòng)態(tài)觀測(cè)到某些器官中活性氧自由基的產(chǎn)生,對(duì)它們的生成機(jī)制,生理作用及其動(dòng)態(tài)損傷生物機(jī)體的過(guò)程都缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù),以至在臨床上直接影響和限制了對(duì)許多疾病的治療效果;對(duì)發(fā)展抗逆境植物的培植也是

3、重大障礙.另外,對(duì)于金屬離子的吸收、傳輸、分配、及其與蛋白質(zhì)的等結(jié)合的關(guān)鍵因素還需進(jìn)一步解釋.因此,針對(duì)生物活體內(nèi)自由基及金屬離子開(kāi)創(chuàng)新的分析與檢測(cè)技術(shù)是分析化學(xué)學(xué)科發(fā)展中具有挑戰(zhàn)性的前沿課題之一. 熒光光譜分析及成像技術(shù)由于其方法的靈敏度高、選擇性好,在分析化學(xué),特別是生物分析領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛.大多數(shù)生物分子本身無(wú)熒光或熒光微弱,檢測(cè)靈敏度較低,為使之高靈敏地檢出,人們用熒光標(biāo)記試劑或熒光生成試劑與待測(cè)物進(jìn)行標(biāo)記或衍生,生成具有高

4、熒光強(qiáng)度的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的物質(zhì),大大降低檢出限.相對(duì)于常規(guī)熒光檢測(cè)而言,在近紅外熒光光區(qū),生物樣品基體光吸收或熒光強(qiáng)度很小,因而背景干擾大大降低.近紅外熒光探針由于其特殊的光物理和光化學(xué)特性而具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬的優(yōu)點(diǎn),且其測(cè)定條件適宜生命體的生理環(huán)境而被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域.因此,設(shè)計(jì)合成對(duì)某種金屬離子或自由基有高選擇性和靈敏度,具有合適光譜性質(zhì)的熒光探針,在化學(xué)環(huán)境下試驗(yàn)其性質(zhì),結(jié)合熒光成像技術(shù),實(shí)時(shí)在線檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

5、某種金屬離子的濃度變化及在各個(gè)區(qū)域的分布,探討各種金屬離子在生命活動(dòng)中所發(fā)揮的作用以及對(duì)某種離子缺陷時(shí)出現(xiàn)的病理進(jìn)行研究,實(shí)現(xiàn)自由基的生物活體內(nèi)(in vivo)與直接原位(in situ)的檢測(cè),探索自由基爆發(fā)時(shí)的致病機(jī)理,將為生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)的研究提供必要的依據(jù). 熒光探針具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),但是他的靈敏度卻受到很多方面的影響,如光漂白、探針?lè)肿訚舛鹊淖兓?、探針?lè)肿铀幍沫h(huán)境變化(如pH,極性,溫度等等)以及光穩(wěn)定性.熒光共振能

6、量轉(zhuǎn)移(FRET)原理可以克服這些缺點(diǎn),從而可以用于選擇性的檢測(cè)自由基以及金屬離子等. 本論文基于活性物質(zhì)如自由基及金屬離子與熒光探針作用導(dǎo)致熒光性質(zhì)的改變以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(FRET),開(kāi)展了三方面的工作.(一) 設(shè)計(jì)合成了用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Zn<'2+>的近紅外熒光探針--二(2-吡啶甲基)氨基花菁,用普通熒光法對(duì)鋅離子進(jìn)行定量分析測(cè)定,研究了反應(yīng)機(jī)理,并將其用于細(xì)胞內(nèi)zn<'2+>的成像檢測(cè),為進(jìn)一步研究用于細(xì)胞內(nèi)成像的近