細(xì)胞內(nèi)功能性活性物種（自由基、金屬離子）的新型熒光探針的設(shè)計(jì)合成及其可視化成像分析.pdf

1、動(dòng)植物體內(nèi)存在著大量的微量或痕量的活性物種(自由基、金屬離子)，它們對(duì)生命過(guò)程具有著重要的影響，具有特殊的生理功能。它們既是生物體所必需的物質(zhì)，但在某些環(huán)境(如脅迫)下又會(huì)給生物體帶來(lái)?yè)p傷。如果想要詳細(xì)了解它們的生物學(xué)功能，就必需能夠及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。但又由于生物成分本身的多樣性、復(fù)雜性，對(duì)這些微量生物分子的研究就必須采用專(zhuān)一選擇性、高靈敏度的分析方法。因而發(fā)展選擇性好、靈敏度高的分子熒光探針，對(duì)動(dòng)、植物活體細(xì)胞中的活性物種動(dòng)態(tài)、

2、原位可視化成像分析是目前生命科學(xué)研究的重要熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。 在活性物種中，活性氧(ROS，Reactive Oxygen Species)自由基中的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物(ROOH)一直受到人們的廣泛關(guān)注，脂質(zhì)氫過(guò)氧化物出現(xiàn)在脂質(zhì)過(guò)氧化的早期，并迅速降解成烷烴、羰基化合物等產(chǎn)物，對(duì)它的準(zhǔn)確檢測(cè)能夠?yàn)橹|(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的研究提供有利的證據(jù)；羥基自由基(OH)是生命新陳代謝過(guò)程產(chǎn)生的活性氧中，目前已知氧化性最強(qiáng)的自由基，它進(jìn)攻產(chǎn)生位點(diǎn)的蛋白質(zhì)、脂

3、質(zhì)和DNA，進(jìn)而引發(fā)次級(jí)的自由基反應(yīng)，導(dǎo)致無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞損傷；因此開(kāi)展ROOH與OH動(dòng)態(tài)、原位檢測(cè)不但是生命科學(xué)研究所迫切需求的，同時(shí)也是化學(xué)研究中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。此外，鐵是生物體所必需的金屬元素，但是研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的螯合的鐵被認(rèn)為對(duì)多種細(xì)胞損傷是一個(gè)決定性的致病因子，尤其是細(xì)胞胞漿內(nèi)痕量的亞鐵離子能夠催化Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生氧化性極強(qiáng)的羥基自由基；如果想要對(duì)Fe2+的生物學(xué)功能深入的了解，就必需發(fā)展出高選擇性、高靈敏度的新型檢測(cè)方法

4、。 本論文為了高選擇性、高靈敏度快速識(shí)別和檢測(cè)動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物、羥自由基和亞鐵離子，開(kāi)展了以下三個(gè)方面的研究工作： (一)設(shè)計(jì)合成了一種含有非共軛“前花菁”的新型近紅外熒光探針TCP(tricarbocyanine diphenylphosphine)，用于活細(xì)胞中脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的“可視化"。脂質(zhì)氫過(guò)氧化物對(duì)探針中的含磷五元環(huán)進(jìn)行親核取代反應(yīng)，導(dǎo)致五元環(huán)打開(kāi)，從而恢復(fù)花菁的共軛結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物具有強(qiáng)熒光。探針的熒光激

5、發(fā)和發(fā)射最大波長(zhǎng)都位于近紅外區(qū)，能夠有效地避免生物系統(tǒng)中背景熒光的干擾，探針對(duì)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物能夠高選擇性地快速響應(yīng)，而且不受其他活性氧和一些生物體內(nèi)物質(zhì)的影響，分析方法的檢測(cè)限為38 pM。結(jié)合共聚焦熒光顯像，探針還實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)氫過(guò)氧化物在活的巨噬細(xì)胞、正常的人體肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的“可視化"。此外，通過(guò)MTT毒性實(shí)驗(yàn)證明探針是低細(xì)胞毒性，而且探針的性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，結(jié)果為動(dòng)、植物其它細(xì)胞中脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的分析提供了理想的探針與分析方法。

6、 (二)基于順磁性的哌啶醇氮氧自由基(TEMPO)與熒光團(tuán)BODIPY之間分子內(nèi)電子交換導(dǎo)致其熒光猝滅的機(jī)理，將TEMPO與BODIPY通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái)，設(shè)計(jì)合成了一種新型熒光探針rEMPO-BDP以檢測(cè)生物體系內(nèi)的羥基自由基。檢測(cè)的原理是羥基自由基能夠與DMSO快速反應(yīng)生成甲基自由基，探針與甲基自由基結(jié)合后的產(chǎn)物發(fā)出強(qiáng)熒光。在模擬生物體系中，探針能夠迅速地、高選擇性地對(duì)羥基自由基進(jìn)行定量檢測(cè)，分析方法的靈敏度高，檢測(cè)限為18pM

7、。探針還被成功地應(yīng)用于未經(jīng)PMA刺激和經(jīng)過(guò)：PMA刺激的活的小鼠巨噬細(xì)胞中，對(duì)所產(chǎn)生的羥基自由基進(jìn)行了特異性的識(shí)別檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了羥基自由基在活細(xì)胞內(nèi)的“可視化"，并且證明了探針的低細(xì)胞毒性。此外，探針還分別對(duì)正常的和博萊霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生肺組織纖維化的以及治療后的大鼠的胸腔灌洗液，進(jìn)行了羥基自由基的有效測(cè)定，從而證明了該探針是動(dòng)、植物樣品及細(xì)胞中OH檢測(cè)的理想探針。 (三)本論文設(shè)計(jì)合成了一種連有兩個(gè)噻吩的BODIPY結(jié)構(gòu)的熒光分子探針