選擇性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)熒光探針的合成及其生物應(yīng)用.pdf

1、硫醇是生物體中許多蛋白質(zhì)和小分子的重要組成部分，在細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)中具有重要的作用。細(xì)胞內(nèi)硫醇的水平與白細(xì)胞缺失、牛皮癬、肝損傷、癌癥以及艾滋病等許多疾病有著直接的聯(lián)系。對(duì)細(xì)胞內(nèi)硫醇類物質(zhì)的檢測(cè)有助于闡明還原體系在整個(gè)細(xì)胞氧化還原網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)控作用。近年來，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)硫醇類物質(zhì)的研究越來越多，其中熒光法簡(jiǎn)單易行，便于操作，具有高靈敏度、高選擇性和廣泛可用的熒光染料等特點(diǎn)。更加吸引人的是探針分子可以在不破壞生物活性的情況下進(jìn)入細(xì)胞，與活細(xì)

2、胞內(nèi)的硫醇結(jié)合生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，并借助于激光共聚焦成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)硫醇的“可視化”，從而對(duì)它們?cè)谏w內(nèi)進(jìn)行“實(shí)時(shí)在線”的檢測(cè)。
　　目前，用于檢測(cè)生物體內(nèi)硫醇的熒光探針發(fā)展迅速，然而能夠用于生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)快速檢測(cè)硫醇的熒光探針少有報(bào)道，因此我們的主要目的在于設(shè)計(jì)高選擇性、高靈敏度的，能夠快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)硫醇的熒光探針。本論文基于熒光探針與硫醇類物質(zhì)特異性作用后熒光光譜性質(zhì)的改變從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其的檢測(cè)。本文主要開展了以下兩方面的研究工

3、作:
　　(一)基于馬來酰亞胺基團(tuán)對(duì)巰基的特異性響應(yīng)，以吖啶衍生物為母體設(shè)計(jì)合成了一種新的含有兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)、可以快速檢測(cè)非蛋白硫醇的熒光探針。探針本身熒光較弱，與非蛋白硫醇以1:2的比例反應(yīng)后熒光增強(qiáng)明顯，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于380nm和440nm。由于探針分子中兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)是鄰位取代的，空間距離很近，當(dāng)探針與蛋白硫醇以1:1的比例反應(yīng)之后，受體積較大的蛋白硫醇影響，未反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)空間位阻變大，很難繼續(xù)與其他

4、蛋白硫醇反應(yīng)，從而繼續(xù)猝滅母體熒光團(tuán)的熒光，導(dǎo)致探針熒光無法恢復(fù)，因此探針對(duì)蛋白硫醇沒有響應(yīng)；非蛋白硫醇由于體積較小，可以與探針分子以2:1的比例反應(yīng)而使探針熒光明顯增強(qiáng)。在室溫、生理 pH值條件下探針能夠快速檢測(cè)非蛋白硫醇，1.5μM探針與1.0μM谷胱甘肽在小于1 min內(nèi)即反應(yīng)結(jié)束，蛋白硫醇、生物體內(nèi)的活性氧、金屬離子及其他抗氧化劑均對(duì)測(cè)定沒有干擾。在1.0×10-8-1.5×10-6 M范圍內(nèi)谷胱甘肽的濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性

5、關(guān)系，方法的檢測(cè)限為7.7nM。為了比較兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)之間的空間距離對(duì)反應(yīng)速率的影響，本文同時(shí)合成了間二馬來酰亞胺取代的化合物作為對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)巰基響應(yīng)基團(tuán)處于間位時(shí)與非蛋白硫醇反應(yīng)速率比鄰位時(shí)速率慢很多，推測(cè)是由于鄰位取代時(shí)兩個(gè)取代基團(tuán)空間距離太近而存在空間位阻效應(yīng)(空間位阻效應(yīng)可以使反應(yīng)速率加快)，使得探針本身能量較高而不如間位取代的化合物穩(wěn)定，從而更易與谷胱甘肽反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)探針溶液在室溫下放置三周后，溶液顏色由淺黃