用于細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基檢測(cè)的遠(yuǎn)可見、近紅外熒光探針的設(shè)計(jì)合成及應(yīng)用研究.pdf

1、生物體內(nèi)活性氧自由基水平直接與生物的生理、病理相關(guān),高選擇性識(shí)別與定量自由基是研究自由基參與生命活動(dòng)機(jī)制的前提.本文以熒光素、萘熒光素為熒光發(fā)色團(tuán),基于非氧化機(jī)理,設(shè)計(jì)合成了系列遠(yuǎn)可見、近紅外熒光分子探針,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基及過氧化氫的檢測(cè)及可視化成像;將熒光素系列探針與萘熒光素系列探針優(yōu)化組合,篩選出互不干擾的兩種探針用于超氧陰離子自由基及過氧化氫的同時(shí)檢測(cè),首次實(shí)現(xiàn)同一體系中兩種自由基的同時(shí)分別定量. 本論文主要內(nèi)

2、容如下: 1、基于超氧陰離子自由基的親核性,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一種用于識(shí)別超氧陰離子自由基的新型熒光探針一雙(二苯基次膦酰基)熒光素(FP-1),并通過元素分析,紅外,核磁共振及質(zhì)譜對(duì)探針結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,建立了測(cè)定O<,2> 的普通熒光法.探針試劑本身沒有熒光,與O<,2>反應(yīng)后熒光顯著增強(qiáng),激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于490nm和530nm.該探針能高選擇性地捕獲O<,2>,而同倍共存的其它活性氧(ROS)及一些生物樣品中常存在的還原性化

3、合物不干擾.該方法在兩段O<,2>濃度范圍內(nèi),1×10<'-10>～1×10<'-8>和1×<,10-6>～8×<,10-6> moll<'-1>,與熒光增強(qiáng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,最低檢測(cè)限為4.6pM,具有很高的靈敏度.利用激光共聚焦成像技術(shù)對(duì)探針孵育的正常巨噬細(xì)胞、PMA刺激的巨噬細(xì)胞及Tiron試劑處理的巨噬細(xì)胞熒光成像,照片顯示探針對(duì)微摩爾級(jí)的O<,2>.產(chǎn)生響應(yīng).實(shí)驗(yàn)表明該熒光探針對(duì)于O<,2>的識(shí)別與檢測(cè)具有選擇性好、靈敏度高

4、、水溶性好及生物兼容性等優(yōu)點(diǎn),且可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)O<'2>的可視化示蹤.研究結(jié)果將為植物體內(nèi)超氧陰離子自由基的檢測(cè)及生理、病理研究提供實(shí)用可靠的探針及實(shí)驗(yàn)方法. 2、設(shè)計(jì)合成了一種新型紅色熒光探針-雙(二苯基次膦?；?萘熒光素(PNF-1),用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基.該探針是基于O<'2>的強(qiáng)親核性促使分子中次膦酸酯迅速水解生成熒光性化合物一萘熒光素來檢測(cè)超氧的,其熒光發(fā)射譜位于662nm處,能有效避免細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾,提高

5、了檢測(cè)的選擇性和靈敏度.實(shí)驗(yàn)方法的最佳條件及線性范圍被獲得,檢測(cè)限為O.1 nM,具有很高的靈敏度.共聚焦細(xì)胞成像顯示探針可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)納摩爾級(jí)的O<,2>產(chǎn)生響應(yīng)(RAW 264.7).結(jié)果顯示該熒光探針對(duì)于O<,2>的識(shí)別與檢測(cè)具有選擇性好、靈敏度高、膜滲透性好等優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)O<,2>的可視化示蹤,對(duì)于活性氧的研究具有重要意義.3、設(shè)計(jì)合成了一種有效用于水相中檢測(cè)超氧陰離子自由基的新型紅色熒光探針一雙(二苯基次膦?；?-5(6)-羧基

6、萘熒光素,用元素分析、紅外、核磁共振等手段對(duì)探針結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,建立了測(cè)定水相中O<,2>的普通熒光法.探針試劑本身無熒光,經(jīng)O<,2>親核性水解次膦酯產(chǎn)生強(qiáng)熒光產(chǎn)物-5(6)-羧基萘熒光素,激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于588nm和667nm.該探針高選擇性捕獲O<,2>,同倍共存的其它活性氧(ROS)不干擾.該方法線性范圍1.0×10<'7>～1.0×10<'-5>moll-<'1>,檢出限為0.25 nM,具有良好的靈敏度4、基于H<,2

7、>O<,2>能特異性催化水解磺酸酯,我們創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)合成了兩種新型近紅外熒光探針一雙(對(duì)甲苯磺?；?萘熒光素(NFDS-1)和雙(全氟辛烷磺?；?萘熒光素(NFDS-2),用于細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的檢測(cè).探針試劑本身沒有熒光,與過氧化氫反應(yīng)后產(chǎn)生熒光產(chǎn)物萘熒光素,激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為602/692nm,位于近紅外區(qū),有效避免了細(xì)胞自發(fā)熒光的背景干擾.實(shí)驗(yàn)表明,脂溶性探針NFDS-1具有良好的膜穿透性,可選擇性捕獲細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫,并且可以對(duì)細(xì)

8、胞內(nèi)納摩爾級(jí)過氧化氫含量的變化產(chǎn)生響應(yīng).盡管NFDS-1的水溶性欠佳,但在二甲基亞砜促溶下,仍然可以有效進(jìn)行水相中過氧化氫的檢測(cè).方法的線性范圍為6.0×10-9～4.0×10<'-6> mol l<'-1>,檢測(cè)限為81.5pM. 研究結(jié)果將為植物體內(nèi)過氧化氫的檢測(cè)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供實(shí)用可靠的探針及實(shí)驗(yàn)方法.5、本文設(shè)計(jì)合成了新型綠色熒光探針一雙(對(duì)甲苯磺酸酯基)熒光素(FS-1)和雙(對(duì)甲苯磺酸酯基)-二氯熒光素(FS-2)

9、,用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫.檢測(cè)原理是基于H<,2>O<,2>能特異性催化水解磺酸酯,給出熒光產(chǎn)物熒光素.實(shí)驗(yàn)表明,探針Fs-1和Fs-2在模擬生物體系中檢測(cè)過氧化氫,具有良好的選擇性和靈敏度,且線性范圍寬.其它種類活性氧和一些生物體內(nèi)存在的還原性化合物,包括O<,2>,OH,NO,ONOO,對(duì)苯二酚,谷胱甘肽和酯酶等基本不干擾.細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明,探針FS-1和FS-2用于PMA刺激或外加不同濃度H<,2>O<,2>孵育的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞