電場(chǎng)誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:晶狀體后囊膜混濁（PCO）是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥。該過程被認(rèn)為是手術(shù)啟動(dòng)了晶狀體的異常損傷修復(fù)反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞（LECs）在后囊膜上增生、移行，并出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）和晶狀體纖維再生。晶狀體上皮損傷影響了晶狀體自身獨(dú)有的電流環(huán)路，產(chǎn)生傷口電位和電場(chǎng)，增加赤道部LECs的增殖。所以有人認(rèn)為白內(nèi)障手術(shù)破壞了晶狀體正常的電流形式和內(nèi)在的電場(chǎng)，使LECs失去晶狀體原有電流及電場(chǎng)的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致LECs發(fā)生EMT，這

2、可能是PCO發(fā)生的部分原因。本實(shí)驗(yàn)通過建立電場(chǎng)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3細(xì)胞的體外作用模型，觀察電場(chǎng)對(duì) HLE-B3細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，如凋亡、增生、形態(tài)及細(xì)胞周期的影響，并檢測(cè)電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞內(nèi)EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響及電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞系 HLE-B3細(xì)胞，并根據(jù)文獻(xiàn)描述建立電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞的作用模型；將細(xì)胞分別暴露于電場(chǎng)強(qiáng)度為50-

3、150mV/mm的電場(chǎng)中，顯微照相系統(tǒng)記錄電場(chǎng)作用前、作用6h、12h及24h的細(xì)胞圖像；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況并選擇合適的電壓。電壓為100mV/mm時(shí)，觀察電場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞增生的影響；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。
　　2)運(yùn)用 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)電場(chǎng)對(duì) HLE-B3細(xì)胞中 EMT標(biāo)志物 E-cadherin、Vimentin及integrinβ1基因表達(dá)的影響；運(yùn)用免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)電

4、場(chǎng)對(duì)HLE-B3細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin, Vimentin及integrinβ1蛋白表達(dá)的影響。
　　3)分別加入 integrinβ1抑制劑 MAB1965和 FAK抑制劑 PF-573,228，觀察HLE-B3細(xì)胞形態(tài)的變化及EMT標(biāo)志物基因、蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步探明電場(chǎng)誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT與integrinβ1-FAK信號(hào)通路之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1）成功建立了電場(chǎng)對(duì) HLE-B3細(xì)胞

5、的作用模型。50mV/mm的電場(chǎng)暴露組中，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。100mV/mm、150mV/mm的電場(chǎng)暴露中，細(xì)胞間隙增加，細(xì)胞胞體伸長(zhǎng)、呈紡錘樣，且細(xì)胞長(zhǎng)軸轉(zhuǎn)向垂直于場(chǎng)線的方向。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，150mV/mm電場(chǎng)強(qiáng)度可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。100mV/mm的電場(chǎng)暴露組中，細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞周期由G1期向S期過渡的抑制。
　　2）分別應(yīng)用免疫熒光、qRT-PCR法和Western blot檢測(cè)EF對(duì)

6、EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響。qRT-PCR法、免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin的基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　3）電場(chǎng)誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞integrinβ1表達(dá)的上調(diào)和FAK的活化。電場(chǎng)聯(lián)合integrinβ1抑制劑MAB1965作用HLE-B3細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示E-

7、cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而電場(chǎng)聯(lián)合 FAK抑制劑 PF-573,228作用后，細(xì)胞形態(tài)依舊出現(xiàn)在電場(chǎng)作用下伸長(zhǎng)的趨勢(shì)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1)100mV/mm的電場(chǎng)引起HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的形態(tài)學(xué)改變，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制HLE-B3細(xì)