2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  為進一步探討年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機制,本研究采用miRNA芯片技術(shù)篩選人眼年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞中miRNA的表達譜,并對hsa-miRNA-15a調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞凋亡機制進行熒光定量分析及細(xì)胞培養(yǎng)過表達檢測,進一步闡明年齡相關(guān)性白內(nèi)障與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系,為白內(nèi)障的基因治療奠定基礎(chǔ)。
  方法:
  1、miRNA芯片篩選miRNA在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞及正

2、常晶狀體上皮細(xì)胞中的表達譜,初步篩選出與年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)的miRNAs表達譜,為miRNAs參與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡行為的機制提供研究基礎(chǔ)。
  本研究采用miRNAs芯片技術(shù),選取5例年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜及5例正常晶狀體前囊膜,檢測兩種晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表達,篩選出與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)且差異大于2倍的miRNAs。
  2、檢測hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、mcl-1在年齡相關(guān)性白內(nèi)

3、障晶狀體上皮細(xì)胞及正常晶狀體上皮細(xì)胞中的表達,研究hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、mcl-1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生過程中的變化,進一步闡明其在白內(nèi)障發(fā)病機制中的作用。
  本研究選取60例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者,包括皮質(zhì)性白內(nèi)障20例、核性白內(nèi)障20例和后囊下型白內(nèi)障20例(分別標(biāo)記為A、B、C組),20例正常晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞做為對照組,采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測hsa-miRN

4、A-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p在對照組和三種不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達;同上述方法,將獲取的晶狀體前囊膜一半用于Real-time PCR,另一半用于Western blot檢測,分別采用這兩種方法檢測其靶基因bcl-2和mcl-1在對照組和三種不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
  3、培養(yǎng)人品狀體上皮細(xì)胞,將hsa-miRNA-15a過表達于人晶狀體上皮細(xì)

5、胞,檢測hsa-miRNA-15a對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響,從而進一步明確其對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的作用。
  選取人晶狀體上皮細(xì)胞進行培養(yǎng),分別轉(zhuǎn)染hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p,采取Real-time PCR驗證其在培養(yǎng)人細(xì)胞中的表達量,電鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,通過MTS、平板克隆細(xì)胞增殖試驗,Hoechst、TUNEL、AnnexinⅤ-FTTC/PI凋亡檢測及細(xì)胞劃痕實驗和Transwel

6、l侵襲遷移實驗檢測細(xì)胞功能學(xué)的改變。
  結(jié)果:
  1.通過對年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體細(xì)胞樣品miRNAs芯片表達譜的結(jié)果分析,以上調(diào)或下調(diào)>2倍為基準(zhǔn),通過篩選,其中有181個miRNAs上調(diào),有114個miRNAs下調(diào)。在這些miRNAs中,有126個上調(diào)超過5倍;有51個下調(diào)超過5倍。
  2.通過Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-1

7、5a-3p、在正常晶狀體上皮細(xì)胞中有少量表達,而在皮質(zhì)性、核性及后囊下型白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞表達量明顯增高,在皮質(zhì)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達水平可達正常晶狀體的5-8倍,在核型白內(nèi)障中達到10倍以上,在后囊下型白內(nèi)障中甚至可達20倍以上。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,hsa-miRNA-15a-5p在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);hsa-miRNA-15a-3p

8、在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Real-time PCR和Western-blot檢測結(jié)果均顯示:bcl-2和mcl-1在正常晶狀體上皮細(xì)胞中可見表達,而在皮質(zhì)性、核性及后囊下型白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達量明顯下調(diào)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,bcl-2在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01

9、);mcl-1在在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
  3.采用經(jīng)典的Taqman探針方法,對轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15 a-3p的人晶狀體上皮細(xì)胞(Human Lens Epithelial,HLE-B3)進行了定量分析。結(jié)果顯示在HLE-B3細(xì)胞中未檢測到hsa-miRNA-15a-5p或hsa-miRNA-

10、15a-3p,可能極低甚至不表達這兩種miRNA;轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p的HLE-B3細(xì)胞中,這兩種miRNA表達均有顯著提高。細(xì)胞形態(tài)顯示轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA的細(xì)胞,從24h就開始發(fā)生改變,細(xì)胞變大變圓,輪廓不清,交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少。MTS結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA之后,其生長明顯受到抑制。hsa-miRNA-15a-3p對HLE-B3生長的最大抑制率達到57.13%,hsa-m

11、iRNA-15 a-5p對HLE-B3生長的最大抑制率達到44.60%。平板克隆結(jié)果顯示hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15 a-3p對HLE-B3細(xì)胞的克隆形成能力也有明顯的抑制作用,TUNEL凋亡檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA的HLE-B3細(xì)胞檢測到明顯的綠色熒光,說明這兩種miRNA誘發(fā)了HLE-B3細(xì)胞的凋亡。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測顯示轉(zhuǎn)染后的HLE-B3細(xì)胞,其細(xì)胞碎片明顯

12、多于對照組;劃痕實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p的HLE-B3細(xì)胞的水平遷移能力受到明顯抑制,而轉(zhuǎn)染hsa-miRNA-15a-3p的細(xì)胞沒有影響。
  結(jié)論:
  1.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中miRNAs表達譜與正常晶狀體上皮細(xì)胞表達譜有差異,差異表達的miRNAs可能參與了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。
  2 hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p在三種不同類型的年

13、齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達均較正常晶狀體上皮細(xì)胞表達升高;而bcl-2和mcl-1均較正常晶狀體上皮細(xì)胞表達降低。hsa-miRNA-15 a-5p、hsa-miRNA-15a-3p可能通過抑制其靶基因bcl-2和mcl-1的表達促使細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生。
  3.hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞后抑制細(xì)胞增殖及克隆,促使晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡,從而啟動了

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