MiRNA-138對(duì)氣道上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化影響的研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的慢性疾病。氣道重塑重要標(biāo)志為氣道上皮細(xì)胞脫落，細(xì)胞之間的緊密連接和粘附連接被破壞，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖，引起基底膜增厚和上皮下纖維化。氣道上皮細(xì)胞上皮．間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)改變被認(rèn)為參與了這一過程。目前認(rèn)為氣道上皮損傷和異常修復(fù)是哮喘氣道重塑的重要發(fā)病機(jī)制，氣道重塑可能與氣道上皮細(xì)胞EMT

2、密切相關(guān)。EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細(xì)胞的過程。許多研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者及小鼠肺泡灌洗液及氣道壁內(nèi)TGF-β1增高，因此TGF-β1與哮喘氣道重塑密切相關(guān)，而且TGF-β1是誘導(dǎo)EMT的重要細(xì)胞因子。
　　MiRNA是重要的負(fù)性基因表達(dá)調(diào)控因子，通過其種子序列識(shí)別靶mRNA3’-UTR端非翻譯區(qū)并特異性結(jié)合而抑制其靶基因的翻譯。研究表明上調(diào)miRNA-138可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞如A549細(xì)胞株發(fā)生EMT。MiRNA-138抑制

3、肺上皮來源的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，是否也在氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生EMT過程中異常表達(dá)，上調(diào)miRNA-138能否也抑制氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，從而抑制氣道重塑？因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討TGF-β1是否能誘導(dǎo)小鼠氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及miRNA-138能否阻止TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，從而為研究哮喘氣道重塑機(jī)制提供依據(jù)。
　　目的：
　　驗(yàn)證TGF-β1是否可以誘導(dǎo)小鼠氣道上皮細(xì)胞株TC-1發(fā)生EMT;驗(yàn)證miRNA-1

4、38是否在TC-1細(xì)胞株發(fā)生EMT時(shí)異常表達(dá);
　　驗(yàn)證miRNA-138過表達(dá)能否抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT;
　　方法：
　　1、予TGF-β1刺激小鼠氣道上皮細(xì)胞株TC-1細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)TC-1細(xì)胞株的EMT相關(guān)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況，RT-qPCR檢測(cè)miRNA-138的表達(dá)情況。
　　2、予攜帶cy3熒光片段的miRNA-138 mimic轉(zhuǎn)染

5、TC-1細(xì)胞株，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-qPCR檢測(cè)miRNA-138的表達(dá)。同時(shí)給予TGF-β1刺激轉(zhuǎn)染miRNA-138的TC-1細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)EMT相關(guān)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、予20ng/ml的TGF-β1刺激TC-1細(xì)胞后，相比于正常對(duì)照組，上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin表達(dá)減弱，間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白vimentin、α-SMA、collagen-

6、Ⅰ表達(dá)增強(qiáng);提示TGF-β1可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　2、予10ng/ml的TGF-β1刺激TC-1細(xì)胞24h后，miRNA-138表達(dá)較正常對(duì)照組減弱;提示miRNA-138在氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程中表達(dá)受到抑制。
　　3、TC-1轉(zhuǎn)染miRNA-138 mimic后miRNA-138表達(dá)上調(diào)。給予TGF-β1刺激并轉(zhuǎn)染miRNA-138組上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白vimentin、