擴展青霉脂肪酶“蓋子”結構域突變對其活性影響的研究.pdf

1、為了便于對擴展青霉脂肪酶基因進行分子設計及改造，本論文將擴展青霉脂肪酶成熟肽編碼基因插入到pPIC9K表達載體中，構建重組表達質(zhì)粒pPIC9K-pel，并在脂肪酶基因5’端上游加上（His）6標簽的編碼序列。通過比對擴展青霉脂肪酶與黑曲霉阿魏酸酯酶的氨基酸序列，選擇擴展青霉脂肪酶“蓋子”左右側鉸鏈區(qū)的第66、81、94位氨基酸、整個“蓋子”以及“蓋子”右側鉸鏈區(qū)等五個部位作為突變位點，研究擴展青霉脂肪酶“蓋子”結構及其兩側鉸鏈區(qū)突變對脂

2、肪酶活性的影響。
　　 利用前面構建的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-pel作為模板，采用環(huán)狀質(zhì)粒一步PCR定點突變法對擴展青霉脂肪酶“蓋子”左右兩側鉸鏈區(qū)的三個氨基酸殘基進行突變（T66G、T81P、K94E），獲得含有突變氨基酸殘基編碼序列的重組表達質(zhì)粒，依次為：pPIC9K-pel-T66G、pPIC9K-pel-T81P、pPIC9K-pel-K94E。上述重組表達質(zhì)粒導入到畢赤酵母GS115營養(yǎng)缺陷型菌株，甲醇誘導表達。表達

3、產(chǎn)物經(jīng)過Ni-柱親和純化后，測定其水解4-硝基苯癸月桂酸酯的比活力。實驗結果表明：PELT66G重組脂肪酶的比活力與野生型PEL脂肪酶相近，為5.09 U/mg：而PELT81P和PEIK94E重組脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶分別提高了2.95倍和2.57倍，分別達到19.1U/mg和17.2 U/mg。
　　 其次采用引入酶切位點再環(huán)狀質(zhì)?；貜屯蛔兎ㄖ脫Q了擴展青霉脂肪酶的“蓋子”結構域（68ITDFVND175-71DTNLO

4、LDT78），并與畢赤酵母表達載體pPIC9K構建成重組表達質(zhì)粒，命名為pPIC9K-pel（-lid）；該重組質(zhì)粒導入到畢赤酵母GS115營養(yǎng)缺陷型菌株，甲醇誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-柱純化后，SDS-PAGE電泳能檢測到一條約28 kDa的表達條帶。表達產(chǎn)物經(jīng)橄欖油羅丹明B平板定性檢測沒有酶活。
　　 最后通過重疊延伸PCR置換了擴展青霉脂肪酶的“蓋子”右側鉸鏈區(qū)（76DIA78-79NYT81），突變體插入到載體pPIC9