乳源酵母發(fā)酵牛乳產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究.pdf

1、本文以雪蓮菌菌粒為來源分離乳源酵母菌株，采用培養(yǎng)形態(tài)、生理生化方法和分子生物學(xué)方法對酵母分離株進(jìn)行了鑒定，評價(jià)了不同種的代表菌株蛋白水解活性、發(fā)酵產(chǎn)活性肽的潛力和益生特性，對一株具有很好產(chǎn)活性肽潛力的酵母菌株發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對其發(fā)酵乳中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽進(jìn)行了分離純化和鑒定。
　　從不同地區(qū)來源的雪蓮菌粒中，共分離到66株酵母菌株，經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化特征、26S r DNA的D1/D2區(qū)序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分

2、析，分離出屬于8個(gè)不同種的酵母，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），發(fā)酵畢赤酵母（Pichiafermentans），漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa），涎沫假絲酵母（Candidazeylanoides），近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis），馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxia

3、nus），單孢釀酒酵母（Kazachstania unispora）。其中K.marxianus、Ka.unispora和P.fermentans的出現(xiàn)頻率最高，而P.fermentans，D.hansenii，C.zeylanoides，C.parapsilosis和R.mucilaginosa為首次在雪蓮菌中發(fā)現(xiàn)。
　　菌株S.cerevisiae K11，P.fermentansK14，D.hansenii H2和K.mar

4、xianus Z17具有較好的耐酸性，胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)耐受性，同時(shí)也具備良好的耐受膽鹽能力;在培養(yǎng)條件下和非生長的靜息細(xì)胞狀態(tài)下，4株酵母都表現(xiàn)出降解膽固醇活性，其中K11的降解能力最好。4株酵母均表現(xiàn)出能夠清除DPPH自由基和羥自由基的活性。菌株K11，K14，H2和Z17具有較好的益生特性，可作為優(yōu)良的潛在益生菌株。
　　蛋白降解實(shí)驗(yàn)表明，R.mucilaginosa D2和K.marxianus Z17蛋白水解活性最強(qiáng);S.cere

5、visiae K11，P.fermentans K14，D.hansenii H2，C.zeylanoides D3的蛋白水解活性適中，而C.parapsilosis D4和Ka.unispora K21蛋白水解活性較弱。菌株P(guān).fermentans K14,R.mucilaginosa D2,C.zeylanoides D3,C.parapsilosis D4和K.marxianus Z17發(fā)酵乳多肽的ACE抑制活性較高，其中R.mu

6、cilaginosa D2，P.fermentans K14和K.marxianus Z17具有較好的發(fā)酵牛乳獲得ACE抑制肽的潛力，其發(fā)酵乳多肽的IC50值在53.9-227.6μg/mL之間。菌株P(guān).fermentans K14和K.marxianus Z17發(fā)酵多肽分子量小于3kDa組分顯示了更高的DPPH自由基清除活性。各菌株發(fā)酵乳多肽的羥自由基清除率在7.3％到53.5％之間，其中P.fermentans K14發(fā)酵乳多肽小于

7、3kDa組分的清除率最高。
　　采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了K.marxianus K17發(fā)酵牛乳產(chǎn)ACE抑制肽的條件。發(fā)酵溫度，接種量和轉(zhuǎn)速對ACE抑制活性的影響極顯著，初始pH不顯著。溫度與接種水平以及溫度與轉(zhuǎn)速的相互作用對ACE抑制活性有顯著影響。菌株Z17發(fā)酵牛乳產(chǎn)ACE抑制肽最佳發(fā)酵條件為溫度32℃、初始pH6.5、接種量6％和轉(zhuǎn)速189 r/min，在此條件下發(fā)酵48h，發(fā)酵乳的ACE抑制活性可達(dá)為81.23±2.69％。發(fā)酵

8、過程蛋白水解、肽酶活性和ACE抑制活性的相關(guān)性分析表明，ACE抑制活性(％)和蛋白水解（OPA指數(shù)）呈顯著正相關(guān)，蛋白水解程度（OPA指數(shù)）可作為反映發(fā)酵乳ACE抑制活性的指標(biāo)。氨肽酶和羧肽酶活性與ACE抑制活性有顯著的正相關(guān)性。而胞內(nèi)蛋白酶活性和ACE抑制活性無顯著相關(guān)性，表明ACE抑制肽的釋放可能是由于細(xì)胞內(nèi)肽酶的作用，生成有活性的小肽后再分泌到發(fā)酵乳中。發(fā)酵過程的實(shí)驗(yàn)表明，最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間在穩(wěn)定期中期48h，以實(shí)現(xiàn)最高的ACE抑制活性

9、。
　　采用凝膠過濾色譜、RP-HPLC對K.marxianus Z17菌株發(fā)酵乳所含ACE抑制肽進(jìn)行了分離純化，得到了兩個(gè)抑制活性較好的分離峰P5和P7，IC50值分別為59.2和86.3μg/mL。采用MALDI/TOF-TOF MS/MS質(zhì)譜對P5和P7的序列進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示P5和P7的序列為VLSRYP和LRFF，分別對應(yīng)于κ酪蛋白第31-36位和αs1酪蛋白第21-24位氨基酸的肽段。查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)表明這兩條肽為