血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)換的調(diào)控作用.pdf

1、目的：我國(guó)是一個(gè)肝病大國(guó)，慢性肝病的發(fā)生率相對(duì)較高，而肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)病理改變。肝纖維化具有可逆性，因此，盡早地阻斷和延緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，在一定程度上能有效地控制肝硬化的形成。探討肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的抗肝纖維化藥物是關(guān)系人類生命健康的重大課題，具有重要而深遠(yuǎn)的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。肝纖維化（hepaticfibrosis，HF）是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)，活化的成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞增多，肝臟中膠原

2、蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的增生與降解失衡，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織大量沉積的病理改變。肝纖維化是由多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和氧化應(yīng)激等一系列復(fù)雜作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，在肝損傷過程中，肝內(nèi)三種細(xì)胞即肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和靜息性肝星狀細(xì)胞(Q-HSC)均可受各種細(xì)胞因子的調(diào)控發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，獲得肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFb)特征，表明肝纖維化過程中伴有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（e

3、pithelial mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、粘附及遷移能力等方面獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。其主要表現(xiàn)為:上皮細(xì)胞表型基因如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)下調(diào);間質(zhì)細(xì)胞表型基因如波形蛋白(vimentin)表達(dá)上調(diào);間質(zhì)細(xì)胞功能基因如Ⅰ型膠原(collagenⅠ)表達(dá)增強(qiáng)等。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）是近年來肝纖維化領(lǐng)域的

4、又一研究熱點(diǎn)。研究表明，肝內(nèi)ACE-AngⅡ-AT1R軸與肝纖維化的形成有著密切的聯(lián)系。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS的重要效應(yīng)分子，它通過激活肝星狀細(xì)胞、匯管區(qū)的肌成纖維細(xì)胞及骨髓源性間質(zhì)細(xì)胞等諸多致肝纖維化的潛力細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以誘導(dǎo)人肝細(xì)胞系(HL-7702)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換。因此，本論文通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察AngⅡ是否也可以誘導(dǎo)原代大鼠肝細(xì)胞發(fā)生

5、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換;同時(shí)觀察AngⅡ作用于大鼠肝細(xì)胞系(BRL-3A)后，細(xì)胞遷移能力是否發(fā)生改變。隨著人們對(duì)RAS認(rèn)識(shí)的不斷深化，逐漸發(fā)現(xiàn)了RAS的許多新的組分，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)、血管緊張素1-7(Ang(1-7)、Ang(1-7)的受體Mas等，它們構(gòu)成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，成為RAS的另一重要分支，對(duì)ACE-AngⅡ-AT1R軸具有顯著的抑制作用。Ang(1-7)在體內(nèi)外能與AT1R競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，拮

6、抗AngⅡ的活性，發(fā)揮抗纖維化的作用。因此，本論文通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸是否可以抑制AngⅡ的作用，抑制肝細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的發(fā)生，發(fā)揮抗肝纖維化作用。
　　 方法：⑴分離培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞，予不同濃度的AngⅡ刺激原代大鼠肝細(xì)胞48h后，免疫蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)各組中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平的變化;分組為:對(duì)照組、10

7、-9rmmol/L AngⅡ處理組、10-7mmol/LAngⅡ處理組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。分離培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞，予10-7mol/L AngⅡ分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)處理原代大鼠肝細(xì)胞，免疫蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法檢測(cè)各組中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平的變化;分組為:24小時(shí)對(duì)照組、AngⅡ處理24小時(shí)組、48小時(shí)對(duì)照組、AngⅡ處理48小時(shí)組、72小時(shí)對(duì)照組、A

8、ngⅡ處理72小時(shí)組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。AngⅡ刺激大鼠肝細(xì)胞系(BRL-3A)48小時(shí)后，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)法觀察細(xì)胞遷移能力的改變;分組為:對(duì)照組、AngⅡ刺激組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。⑵分離培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞，予不同刺激處理原代大鼠肝細(xì)胞，免疫蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)各組中vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平的變化;分組為:對(duì)照組、AngⅡ刺激組、Ang(1-7)刺激組、AngⅡ+Ang(1-7)處理

9、組、AngⅡ+Ang(1-7)+A779處理組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。⑶構(gòu)建lentiACE2慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞系(BRL-3A)，免疫蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)各組中collagen、vimentin、E-cadherin、albumin蛋白表達(dá)水平的變化;分組為:對(duì)照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiACE2+A779處理組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。構(gòu)建lentiACE2慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞系

10、(BRL-3A)，予不同刺激處理后，免疫蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)各組中vimentin、albumin蛋白表達(dá)水平的變化;分組為:對(duì)照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiGFP+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ+A779處理組、AngⅡ刺激組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。構(gòu)建lentiACE2慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞系(BRL-3A)，予不同刺激處理后，Tra

11、nswell侵襲實(shí)驗(yàn)法觀察細(xì)胞遷移能力的改變;分組為:對(duì)照組、lentiGFP組、lentiACE2組、lentiGFP+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ處理組、lentiACE2+AngⅡ+A779處理組、AngⅡ刺激組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。⑷Wistar大鼠構(gòu)建假手術(shù)組大鼠模型(sham)、膽管結(jié)扎肝纖維化組大鼠模型(BDL)及BDL基礎(chǔ)上Ang(1-7)治療組模型(BDL+Ang(1-7)，對(duì)肝組織進(jìn)行ISHAK及METAV

12、IR肝纖維化評(píng)分和Masson染色。⑸將人肝組織冰凍切片進(jìn)行albumin+collagen免疫熒光雙染;分組為:正常組、肝纖維化組，進(jìn)一步觀察肝細(xì)胞是否發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換。
　　 結(jié)果：⑴不同濃度的AngⅡ刺激原代大鼠肝細(xì)胞48h，與對(duì)照組相比，10-9mmol/LAngn組和10-7mmol/L AngⅡ組肝細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），collagen、vimentin蛋白表達(dá)增多（P＜0.05）

13、;與10-9mmol/L AngⅡ組相比，10-7mmol/L AngⅡ組肝細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P＜0.05); collagen、vimentin蛋白表達(dá)增多(P＜0.05）。不同時(shí)間點(diǎn)10-7mmol/LAngⅡ處理原代大鼠肝細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激組原代大鼠肝細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志collagen、vimentin蛋白增加不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，上皮標(biāo)志E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)

14、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;培養(yǎng)48小時(shí)，AngⅡ刺激組與對(duì)照組相比，collagen、vimentin蛋白明顯增加(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;培養(yǎng)72小時(shí)，AngⅡ刺激組與對(duì)照組相比，collagen蛋白增加不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，vimentin蛋白明顯增加(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E-cadherin蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AngⅡ

15、刺激大鼠肝細(xì)胞系(BRL-3A)48小時(shí)后，AngⅡ刺激組遷移細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵分離培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞，予不同刺激處理48h后，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激組的E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，vimentin蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與AngⅡ組相比，AngⅡ+Ang(1-7)處理組E-cadherin蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），vimentin

16、蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與AngⅡ+Ang(1-7)處理組相比，AngⅡ+Ang(1-7)+A779處理組E-cadherin蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，virnentin蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建lentiACE2慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入大鼠肝細(xì)胞系(BRL-3A)中。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染ACE2慢病毒的大鼠肝細(xì)胞albumin和上皮標(biāo)志E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增加(

17、P＜0.05)，間質(zhì)標(biāo)志collagen、vimentin蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AngⅡ干預(yù)慢病毒ACE2轉(zhuǎn)染的BRL-3A細(xì)胞，析因分析結(jié)果示:病毒轉(zhuǎn)染及AngⅡ兩因素間存在交互效應(yīng)，ACE2轉(zhuǎn)染組能顯著抑制AngⅡ引起的albumin表達(dá)下降、vimentin表達(dá)上調(diào)。⑷通過對(duì)Sham組、BDL組及BDL+Ang(1-7)組大鼠肝組織Masson染色進(jìn)行ISHAK及METAVIR肝纖維化評(píng)分發(fā)現(xiàn)，BDL組模

18、型組膠原纖維染色及肝纖維化評(píng)分顯著高于Sham組（P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而BDL+Ang(1-7)組膠原纖維染色及肝纖維化評(píng)分顯著低于BDL模型組(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但兩者均較Sham組高。⑸人肝組織冰凍切片albumin+collagen免疫熒光雙染結(jié)果顯示:正常組中同時(shí)表達(dá)albumin（綠色）和collagen（紅色）的細(xì)胞較少，而肝纖維化組中同時(shí)表達(dá)albumin（綠色）和collagen（紅色）