水稻瘤矮病毒經(jīng)介體昆蟲水平和垂直傳播的機(jī)制.pdf

1、由水稻瘤矮病毒（RGDV）引起的水稻瘤矮病在我國南方稻區(qū)一直處于持續(xù)流行態(tài)勢，是重要的水稻病害之一。RGDV由介體電光葉蟬以持久增殖型的方式進(jìn)行傳播，并且可以垂直傳播。病害的流行與介體昆蟲的傳播有著直接的關(guān)系，因此本論文對RGDV突破介體昆蟲唾液腺屏障水平傳播至植物以及經(jīng)介體昆蟲生殖系統(tǒng)垂直傳播至子代的機(jī)制進(jìn)行了研究，探討了不同傳播方式對田間病害流行的影響。
　　持久性病毒在介體昆蟲內(nèi)侵染循環(huán)，最后到達(dá)唾液腺，跨過唾液腺細(xì)胞中的內(nèi)

2、腔質(zhì)膜釋放到唾液中。圍成內(nèi)腔的質(zhì)膜作為病毒在蟲體內(nèi)的最后一道膜屏障，對于病毒的傳播起著決定作用。本研究首先利用電鏡技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，觀察了 RGDV突破唾液腺釋放屏障的過程，發(fā)現(xiàn) RGDV侵入電光葉蟬唾液腺后，自身編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns11可以形成纖維狀結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)通過與質(zhì)膜的主要組分肌動(dòng)蛋白（actin）互作，一側(cè)結(jié)合在質(zhì)膜上，另一側(cè)附著了病毒粒體，凹陷并形成小泡，以類似―胞吐‖的方式介導(dǎo)病毒跨過質(zhì)膜釋放到唾液中。我們利用RN

3、A干擾技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證Pns11纖維結(jié)構(gòu)在病毒突破唾液腺釋放屏障中的作用。通過微針注射針對 Pns11基因的 dsRNA抑制Pns11纖維結(jié)構(gòu)在唾液腺中的形成，有效地減少了病毒向唾液腺內(nèi)腔中的釋放，并且降低了介體昆蟲的傳毒率。因此，病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns11可以在唾液腺細(xì)胞中形成纖維結(jié)構(gòu)，是介導(dǎo)病毒跨過內(nèi)腔質(zhì)膜釋放屏障的―交通工具‖。這種病毒利用自身形成的內(nèi)含體結(jié)構(gòu)跨過內(nèi)腔質(zhì)膜的方式是蟲傳病毒突破唾液腺屏障的新模型。
　　病毒隨著唾液

4、一起傳播到植物，唾液作為病毒從昆蟲進(jìn)入植物的載體，對于病毒-介體昆蟲-植物三者之間的互作起著―橋梁‖的作用。本研究分別收集了帶毒和無毒電光葉蟬的水狀唾液，利用蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（Label-free technology）進(jìn)行了測定，通過與電光葉蟬唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對，共鑒定獲得了955個(gè)蛋白。通過定量分析發(fā)現(xiàn)，獲得的蛋白中有209個(gè)為帶毒昆蟲的唾液所特有，有237個(gè)是無毒昆蟲的唾液特有，其分子功能的類別主要富集在氧化還原酶相關(guān)的條目

5、中，這類酶可以幫助昆蟲對抗植物因被取食而產(chǎn)生的具有毒害作用的酚類物質(zhì)，具有一定的―解毒‖作用，影響著昆蟲的取食。因此RGDV的侵染使介體電光葉蟬的唾液組分發(fā)生了變化，并且可能影響昆蟲取食的效率。
　　病毒從親代傳遞給子代，叫做垂直傳播。病毒經(jīng)介體昆蟲的垂直傳播對毒源的維持和病害的發(fā)生具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)， RGDV從親代到子代昆蟲的垂直傳播效率高達(dá)80％以上，但是帶毒雌蟲卵巢的侵染率僅有25%左右。本研究首先通過帶毒和無毒昆

6、蟲的交配實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)帶毒雌蟲與帶毒雄蟲（V♀×V♂）交配后的子代昆蟲帶毒率約為81%，無毒雌蟲與帶毒雄蟲（N♀×V♂）交配后的子代昆蟲帶毒率約為73%，而帶毒雌蟲與無毒雄蟲（V♀×N♂）交配的子代昆蟲帶毒率僅為22%，因此RGDV可以經(jīng)父本進(jìn)行垂直傳播，并且這種垂直傳播方式非常高效且處于主導(dǎo)地位。利用電鏡和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步研究了RGDV經(jīng)父本進(jìn)行垂直傳播的路徑。發(fā)現(xiàn)RGDV附著在電光葉蟬精子的頭部，被精子攜帶通過交配進(jìn)入雌蟲，在產(chǎn)卵

7、時(shí)隨精子通過授精作用進(jìn)入卵中傳遞至子代。體外孵育實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RGDV的主要外殼蛋白P8可以特異結(jié)合在精子頭部。通過GST pull-down釣取與 P8互作的精子蛋白，獲得了硫酸乙酰肝素糖蛋白（HSPG）候選受體。進(jìn)一步通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和pull-down實(shí)驗(yàn)，明確了P8與HSPG的結(jié)構(gòu)功能域III存在互作。免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，HSPG分布在精子頭部的質(zhì)膜上，病毒粒體結(jié)合在HSPG上。利用HSPG抗體孵育精子后可以體外阻斷病毒與精子的

8、結(jié)合。因此，RGDV通過外殼蛋白P8與電光葉蟬精子頭部質(zhì)膜的HSPG蛋白互作，介導(dǎo)精子攜帶病毒通過交配傳至子代。
　　生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RGDV的侵染會(huì)顯著縮短電光葉蟬雌性成蟲的壽命，但對雄性成蟲的壽命和交配能力不造成顯著影響。無毒雌蟲與帶毒雄蟲交配（N♀×V♂）產(chǎn)下的卵，其孵化率和形態(tài)與無毒蟲間交配（N♀×N♂）產(chǎn)下的卵接近，明顯優(yōu)于帶毒雌蟲與無毒雄蟲交配所產(chǎn)的卵。因此推測RGDV更適合于在雄蟲中存在，RGDV經(jīng)雄蟲垂直傳播對種群

9、的不利影響較小。田間調(diào)查結(jié)果顯示，電光葉蟬是田間的主要介體昆蟲，其帶毒率與田間發(fā)病程度有一定相關(guān)性，且雄蟲的帶毒率顯著高于雌蟲。越冬期田間缺少寄主植物，越冬代昆蟲的帶毒率直接影響著次年水稻種植期的葉蟬帶毒率和田間發(fā)病程度，因此病毒在電光葉蟬中的垂直傳播對毒源維持和病害發(fā)生具有重要意義。
　　綜上所述，本論文明確了 RGDV在電光葉蟬中突破唾液腺釋放屏障進(jìn)行水平傳播的機(jī)制，分析了 RGDV侵染對介體昆蟲唾液蛋白造成的變化，發(fā)現(xiàn)了 R