細胞自噬在電光葉蟬傳播水稻瘤矮病毒過程中的功能研究.pdf

1、水稻瘤矮病毒（RGDV）主要由介體電光葉蟬（Recilia dorsalis）進行傳播。近年來關于電光葉蟬與RGDV互作方面的研究相繼增多，但在探究電光葉蟬先天免疫機制方面還不多。病毒通過侵染宿主細胞來實現(xiàn)其存活并增殖，自噬作為一種有效的防御途徑，可以保護細胞免于受病原微生物的侵害。明確 RGDV侵染介體電光葉蟬對細胞自噬反應的影響，可為闡明電光葉蟬傳播RGDV的特異性機理提供依據(jù)。
　　本研究主要探討 RGDV是否會誘導介體昆蟲

2、培養(yǎng)細胞及蟲體內的自噬反應，進而影響自身的增殖和擴散，以揭示 RGDV與介體昆蟲互作的機制。首先分析電光葉蟬轉錄組中自噬Marker蛋白Atg8的基因和氨基酸序列，設計特異引物克隆 Atg8基因全長片段。隨后連接至pDEST17原核表達載體，轉化Rosetta菌誘導表達，SDS-PAGE后收集目的蛋白條帶，免疫小白鼠，制備抗Atg8多克隆抗體，并交聯(lián)熒光素。接下來利用免疫熒光標記技術在 RGDV侵染的電光葉蟬培養(yǎng)細胞中標記自噬蛋白 At

3、g8和 RGDV外殼蛋白 P8，結果表明， RGDV侵染電光培養(yǎng)細胞可以誘導細胞自噬現(xiàn)象的發(fā)生，并且自噬隨著RGDV在細胞內的增殖擴散而逐漸增強。進一步解剖攜帶RGDV的電光葉蟬組織器官，運用免疫熒光標記檢測自噬蛋白 Atg8與RGDV外殼蛋白P8在各個組織器官中的定位情況，結果表明自噬現(xiàn)象僅發(fā)生在電光葉蟬中腸中，唾液腺、精巢和卵巢中均未見特異的顆粒狀的自噬蛋白。這表明RGDV僅誘導了電光葉蟬中腸的自噬反應。
　　為了明確 RGD

4、V誘導的細胞自噬對病毒增殖和擴散的影響，采用自噬抑制劑（3-MA）和誘導劑（Rapamycin）以及RNA干擾（RNAi）處理電光葉蟬培養(yǎng)細胞和蟲體抑制或誘導細胞自噬，免疫熒光標記和RT-qPCR檢測結果都顯示誘導細胞自噬，有利于病毒在細胞或蟲體內的擴散，抑制自噬則不利于病毒的擴散。傳毒實驗進一步表明，誘導細胞自噬促進介體昆蟲的傳毒效率。
　　因此，RGDV侵染電光葉蟬培養(yǎng)細胞和蟲體均可誘導細胞自噬的發(fā)生，且誘導自噬可促進 RGD