弓形蟲(chóng)慢性感染模型和檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞原蟲(chóng)，能感染幾乎所有的恒溫動(dòng)物（包括人類），引起人獸共患的弓形蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)呈世界性分布，估計(jì)全世界成年人中至少有1/3的人感染，歐洲一些發(fā)達(dá)國(guó)家感染率高達(dá)80％以上。弓形蟲(chóng)作為一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊，造成隱性感染；而當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或受抑制（如惡性腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等）時(shí)，處于隱性感染狀態(tài)的蟲(chóng)體就會(huì)活化，迅速增

2、生繁殖，破壞宿主細(xì)胞而引起多器官的損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致宿主死亡。婦女在妊娠早期感染弓形蟲(chóng)可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎，或引起胎兒先天性弓形蟲(chóng)病，表現(xiàn)為智力低下、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、癲癇等，這些癥狀可在胎兒出生時(shí)或是成長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)。因此，弓形蟲(chóng)病的診斷和疫苗研制對(duì)于保護(hù)易感人群以及促進(jìn)人類優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。 弓形蟲(chóng)感染的特點(diǎn)是機(jī)會(huì)性致病，其生物學(xué)基礎(chǔ)是速殖子和緩殖子的相互轉(zhuǎn)換，目前對(duì)弓形蟲(chóng)病的治療仍以藥物為主，對(duì)速殖子的殺滅作用較明顯，對(duì)

3、包囊內(nèi)的緩殖子幾乎沒(méi)有作用。因此，建立一個(gè)穩(wěn)定、持續(xù)的弓形蟲(chóng)慢性感染動(dòng)物模型對(duì)進(jìn)一步研究弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子轉(zhuǎn)換機(jī)制、藥物篩選、弓形蟲(chóng)病的診斷及疫苗等研究具有重要的意義。目前對(duì)于弓形蟲(chóng)不同期特異性抗原分子的差異性表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，許多弓形蟲(chóng)基因已從速殖子中克隆、鑒定，其中大多數(shù)基因編碼的蛋白為速殖子與緩殖子共有，只有少數(shù)幾個(gè)被證實(shí)為速殖子期特有的，近年來(lái)，由于速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)換機(jī)制引起研究者重視，一些緩殖子及包囊特有蛋白的編

4、碼基因也陸續(xù)被克隆、鑒定。 本研究用弓形蟲(chóng)Prugniaud弱毒株感染小鼠構(gòu)建弓形蟲(chóng)慢性感染模型。同時(shí)對(duì)緩殖子期特異性抗原BAG1（Bradyzoite antigen 1）進(jìn)行基因克隆、蛋白表達(dá)以及對(duì)重組抗原的免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析；純化表達(dá)蛋白以獲得大量高純度的重組蛋白，用于弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠模型和人弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)，為進(jìn)一步診斷和疫苗的研究打下基礎(chǔ)。 目的： 1．克隆與表達(dá)弓形蟲(chóng)緩殖子期特異性BAG1基因，純化

5、表達(dá)的蛋白，并分析重組抗原的免疫反應(yīng)性。 2．構(gòu)建弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠模型。 3．探討重組BAG1抗原在弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠中的檢測(cè)效能。 4．重組BAG1抗原在檢測(cè)人血清中的初步應(yīng)用。 方法： 1．從緩殖子總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA擴(kuò)增出BAG1基因片段，利用限制性內(nèi)切酶和連接酶克隆到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pET-28a（+）表達(dá)載體中，構(gòu)建表達(dá)型重組質(zhì)粒。pET-28a（+）-BAG1，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切

6、及測(cè)序鑒定。 2．將重組質(zhì)粒pET-28a（+）-BAG1轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化工程菌pET-28a（+）-BAG1的表達(dá)條件，大量誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。 3．Western blotting與ELISA分析重組表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)性。 4．采用經(jīng)口感染的方式，用弓形蟲(chóng)Prugniaud株包囊感染昆明小鼠，分別在感染0d、2w、1mon、2mon、3mon、4mon、5mon、6

7、mon和9mon各時(shí)期采血分離血清。 5．重組BAG1抗原檢測(cè)弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠不同時(shí)期血清的IgG和IgM抗體，用重組SAG1和弓形蟲(chóng)速殖子全蟲(chóng)抗原（Toxo-Ag）做平行檢測(cè)。 6．重組BAG1抗原檢測(cè)特殊人群血清IgG和IgM抗體，用rSAG1和Toxo-Ag做平行檢測(cè)。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pET-28a（+）-BAG1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到以可溶性形式表達(dá)的重組BAG1，Western

8、 blotting分析顯示重組BAG1具有特異的免疫反應(yīng)性。 2．成功建立弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠模型； 3．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測(cè)弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠血清IgG抗體。結(jié)果顯示針對(duì)相應(yīng)抗原的小鼠IgG抗體在不同時(shí)間水平有顯著差異（P<0．001）。針對(duì)不同抗原的小鼠IgG抗體有顯著差異，rBAG1-IgG顯著高于rSAG1-IgG和Toxo-Ag-IgG（P<0．001）。時(shí)間與抗原有顯著交互效應(yīng)，主要

9、表現(xiàn)在抗rBAG1與rSAG1、Toxo-Ag的IgC抗體變化趨勢(shì)顯著不同（P<0．001）。 4．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測(cè)弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠血清IgM抗體。結(jié)果顯示針對(duì)相應(yīng)抗原的小鼠IgM抗體在不同時(shí)間水平有顯著差異（P<0．001）。針對(duì)不同抗原的小鼠IgM抗體無(wú)顯著差異，即rBAG1-IgM、rSAG1-IgM以及Toxo-Ag-IgM三者整體水平無(wú)顯著差異（P=0．070）。時(shí)間與抗原有顯著交互效

10、應(yīng)，主要表現(xiàn)在抗rBAG1與rSAG1、Toxo-Ag的IgM抗體變化趨勢(shì)不同（P=0．008）。 5．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測(cè)477份精神分裂癥患者血清中弓形蟲(chóng)IgG抗體，陽(yáng)性率分別為15．30％、11．74％和12．58％。結(jié)果顯示rBAG1與rSAG1兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率有顯著差異（P=0．021），以rBAG1檢測(cè)的陽(yáng)性率較高；兩種抗原檢測(cè)的吻合度一般（k=0．562）。rBAG1與Toxo-Ag

11、兩種抗原檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P=0．111），吻合度一般（r=0．503）。rSAG1與Toxo-Ag兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P=0．665），吻合度一般（k=0．529）。 6．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測(cè)477份精神分裂癥患者血清中弓形蟲(chóng)IgM抗體，陽(yáng)性率分別為8．18％、10．27％和12．79％。結(jié)果顯示rBAG1與rSAG1兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P=0．099），兩種抗原檢測(cè)結(jié)果

12、的吻合度一般（k=0．625）。rBAG1與Toxo-Ag兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率有顯著差異（P=0．001），吻合度一般（k=0．556）。rSAG1與Toxo-Ag兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率有顯著差異（P=0．023），吻合度較強(qiáng)（x=0．754）。 7．rBAG1和rSAG1兩種抗原檢測(cè)254份孕婦血清中的IgG抗體陽(yáng)性率分別為6．30％和5．91％，兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P=1．000），吻合度一般（k=0．691）。兩

13、種抗原檢測(cè)的IgM抗體陽(yáng)性率分別為2．76％和3．94％，兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P=0．581），但兩種抗原檢測(cè)結(jié)果的吻合度較弱（x=0．210）。 8．rBAG1和rSAG1兩種抗原檢測(cè)210份獻(xiàn)血員血清中的IgG抗體陽(yáng)性率分別為6．19％和5．71％，兩種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P=1．000）；兩種抗原檢測(cè)結(jié)果的吻合度一般（x=0．617）。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-

14、BAG1，在大腸埃希菌中以非融合蛋白形式高效、可溶地表達(dá)BAG1基因，獲得的重組蛋白可通過(guò)Ni-NTA純化，Westernblotting顯示重組BAG1蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。 2．利用弓形蟲(chóng)Prugniaud弱毒株包囊經(jīng)口方式感染小鼠，成功建立了弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠模型。 3．將重組BAG1抗原應(yīng)用于弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠和人弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)，結(jié)果顯示重組BAG1抗原具有良好的檢測(cè)效能，在弓形蟲(chóng)慢性感染的診斷方面具有潛在