弓形蟲慢性感染大鼠模型的建立及其在學習記憶能力影響研究中的應用.pdf

1、弓形蟲病是一種廣泛流行于世界各地且嚴重危害健康的人獸共患病，病原體弓形蟲具嗜神經(jīng)細胞性特點，可侵蝕大腦神經(jīng)細胞，導致宿主呈現(xiàn)一種慢性、隱匿或潛在的腦部感染。弓形蟲感染宿主非常廣泛，不同宿主對弓形蟲的易感性不同，并且感染后的癥狀及轉(zhuǎn)歸也不相同。因此選擇適宜的實驗動物建立弓形蟲感染的動物模型，直接關系到研究工作的成敗，建立慢性感染狀態(tài)的動物模型對人畜弓形蟲病的防治研究也具有極大的實用價值。目前，缺乏良好的強毒RH株的慢性感染動物模型，已成為

2、當前弓形蟲病診斷及疫苗評價等相關研究的重要制約因素之一。大鼠與人相似，對弓形蟲感染的敏感性低，感染后多呈隱性感染。因此大鼠感染弓形蟲后的動物模型更易模擬人類感染弓形蟲后的狀況，對研究人類感染弓形蟲的免疫學作用、母嬰傳播以及疫苗的設計和診斷試劑的研發(fā)具有更大的價值。目前國內(nèi)外對大鼠弓形蟲感染的研究已有報道，但大多采用弱毒蟲株如Me49、Fukaya、Pru株等，很少應用弓形蟲強毒(RH)株，并且感染后不易分離檢查到弓形蟲病原體而得到確切的

3、感染依據(jù)。
　　 現(xiàn)有研究表明，弓形蟲慢性感染有改變宿主行為的能力，特別是造成宿主的辨別力、學習記憶能力等的損害。海馬是記憶形成的關鍵受損區(qū)，只有海馬或海馬周圍腦區(qū)受損時，才出現(xiàn)空間定位的記憶障礙。目前關于弓形蟲感染致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害作用機制了解較少，需要進行深入研究。本研究以清潔級實驗動物大鼠為研究對象，建立慢性弓形蟲感染的大鼠動物模型；并應用該動物模型通過物體識別試驗和Morris’水迷宮觀察弓形蟲慢性感染對大鼠的學習認知

4、能力的影響；并研究其海馬組織的細胞因子、抗氧化水平、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和N-甲基天冬氨酸受體(NMDA)、腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量；腦組織神經(jīng)絲(NF)mRNA表達、海馬神經(jīng)元細胞周期、細胞凋亡及其半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和細胞色素C(cytochrome C，Cyt c)表達及其海馬組織的比較蛋白質(zhì)組學等，探討其可能的作用機制。其主要研究內(nèi)容包括：<

5、br>　　 1、弓形蟲慢性感染RH株大鼠模型的建立
　　 通過經(jīng)口或腹腔感染弓形蟲RH株速殖子并輔以免疫抑制方法建立弓形蟲慢性感染的大鼠模型進行了比較和研究。結(jié)果顯示口服感染和腹腔感染弓形蟲RH株90天后進行解剖，在其腦、肝組織印片、勻漿涂片中均未查見弓形蟲速殖子抑或包囊，用B1基因PCR和B1與529bp基因雙重PCR檢測腦組織結(jié)果也為陰性，將部分大鼠腦組織勻漿后接種盲傳小鼠，三代后均未出現(xiàn)臨床癥狀，也無死亡。但在免疫抑制后

6、感染弓形蟲RH株組的大鼠腦組織中有2只通過小鼠接種回復分離成功RH速殖子。同時在感染弓形蟲速殖子二月后再免疫抑制大鼠腦組織的勻漿涂片中4只發(fā)現(xiàn)查見少量弓形蟲速殖子，并在雙重PCR檢測中有7只陽性。說明通過腹腔接種107弓形蟲RH株速殖子可以建立大鼠的隱性感染模型。
　　 2、慢性弓形蟲感染對大鼠的學習記憶能力及其海馬細胞因子和抗氧化水平的影響
　　 通過被動回避實驗和Morris水迷宮試驗，觀察弓形蟲感染9周后對大鼠的學

7、習記憶能力等行為學改變。應用放射免疫技術(shù)檢測大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平，同時以免疫組化檢測NOS活性。應用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量。結(jié)果顯示慢性弓形蟲感染對大鼠的記憶獲得沒有影響，但記憶消失要早于對照組；其Morris水迷宮測試中逃避潛伏期均明顯延長，其距離百分比明顯降低(P<0.05)，感染組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)；但IL-6水平

8、與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。感染組大鼠海馬SOD活性較對照組降低(P<0.05)、海馬MDA含量較對照組升高(P<0.05)。感染大鼠大腦皮層NOS陽性細胞數(shù)增加。提示慢性弓形蟲感染對大鼠的學習記憶能力有影響，其作用機制可能與大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α細胞因子水平升高，自由基清除能力下降，氧化應激反應增強有關。
　　 3、慢性弓形蟲感染對大鼠海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和N-甲基天冬氨酸受體(NM

9、DA)亞單位NR2A、NR2B表達的影響
　　 將4 w大鼠感染弓形蟲速殖子9 w后，應用免疫組化、原位雜交技術(shù)和圖像處理方法分析海馬BDNF，CA1、CA3和齒回狀NR2A和NR2B的表達。結(jié)果顯示：慢性弓形蟲感染組大鼠免疫組化海馬BDNF陽性染色顆粒顯著高于對照組(P<0.05)，原位雜交顯示感染大鼠腦組織中BDNF mRNA表達均增加，海馬陽性雜交信號高于對照組(P<0.05)。慢性弓形蟲感染組大鼠在CA3區(qū)表達的免疫反應

10、灰度值顯著高于正常對照組(P<0.05)，而在CA1區(qū)和齒狀回表達的免疫反應灰度值與對照組相比較差異無顯著性(P>0.05)。慢性弓形蟲感染組大鼠的NR2B蛋白的表達在CA1和CA3區(qū)表達的免疫反應灰度值均顯著高于對照組(P<0.05)；而在齒狀回表達的免疫反應灰度值差異無顯著性(P>0.05)。提示慢性弓形蟲感染大鼠海馬組織BDNF和BDNF mRNA表達增強，弓形蟲慢性感染可影響其海馬NMDA受體表達。
　　 4、慢性弓形蟲

11、感染對大鼠物體識別能力和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量的影響
　　 采用物體識別試驗和高效液相色譜電化學法檢測弓形蟲感染9周后的大鼠物體識別能力和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量。結(jié)果弓形蟲感染大鼠的物體識別分辨指數(shù)(DI)顯著低于對照組(P<0.01)。腦組織中NE、5-HT顯著降低，而DA則顯著升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示慢性弓形蟲感

12、染可能通過影響腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成從而降低物體識別能力和學習記憶能力。
　　 5、慢性弓形蟲感染對大鼠腦組織神經(jīng)絲mRNA表達和T細胞免疫水平的影響
　　 將4周齡雄性SD大鼠感染弓形蟲9周后，應用RT-PCR法檢測大鼠大腦組織中高相對分子質(zhì)量NF(NF-H)、中相對分子質(zhì)量NF(NF-M)和低相對分子質(zhì)量NF(NF-L)mRNA表達水平；應用流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞；酶聯(lián)免疫吸

13、附試驗測定其血清中γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素4(IL-4)水平。結(jié)果顯示弓形蟲感染大鼠大腦組織NF-L mRNA下降為對照組的64.56％；NF-M下降為對照組的95.83％；NF-H下降為對照組的89.47％。弓形蟲感染組大鼠外周血的CD4+T細胞和CD8+T細胞與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義。而感染大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-4水平升高。
　　 6、慢性弓形蟲感染對大鼠海馬神

14、經(jīng)元細胞周期、凋亡及其半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和細胞色素C(Cytochrome C，Cyt c)表達的影響
　　 應用流式細胞術(shù)檢測慢性弓形蟲感染大鼠海馬神經(jīng)元細胞周期和細胞凋亡，以羅丹明123染色檢測其線粒體膜電位，同時以免疫組化法檢測海馬caspase-3和Cyt c蛋白表達。結(jié)果顯示大鼠弓形蟲感染10周后，海馬神經(jīng)元細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，G0/G1期細胞百分率增高(P<0.05)，即出現(xiàn)G0

15、/G1期阻滯，S期細胞減少(P<0.05)；線粒體膜電位降低(P<0.05)；caspase-3和Cyt c蛋白表達則均顯著增高(P<0.05)。提示慢性弓形蟲感染可能導致大鼠海馬神經(jīng)元細胞的凋亡，進而引起一定的認知和學習記憶能力影響。
　　 7、慢性弓形蟲感染大鼠與正常大鼠海馬的比較蛋白質(zhì)組學
　　 通過建立慢性弓形蟲感染的大鼠模型，分離大鼠海馬組織并提取海馬蛋白質(zhì)樣品后，通過比較蛋白組學，分析其差異蛋白。通過基質(zhì)輔助

16、激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對酶解后的肽段進行分析。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(NCBI)檢索，對差異蛋白質(zhì)進行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個蛋白斑點在慢性弓形蟲感染大鼠海馬蛋白雙向電泳圖譜中消失，11個蛋白斑點在2組大鼠海馬組織中含量發(fā)生了3倍以上的變化，其中弓形蟲感染組上調(diào)4個，下調(diào)7個。質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索了16個差異表達蛋白，鑒定了9個蛋白質(zhì)。分別是肌酸激酶、磷酸激酶1、ATP合酶、烯醇化酶、線粒體順烏頭酸酶、谷氨酰合成酶和肌動蛋

17、白等，其表達的差異蛋白功能涉及能量代謝和信號傳遞等過程。蛋白差異點的發(fā)現(xiàn)為揭示弓形蟲感染致海馬損傷的機制以及研究弓形蟲慢性感染致學習記憶能力影響提供了有益的線索。
　　 8、慢性弓形蟲感染大鼠脊髓組織蛋白質(zhì)的雙向電泳分析和質(zhì)譜鑒定
　　 采用雙向凝膠電泳分離脊髓總蛋白，考染顯色，Image Master圖象分析系統(tǒng)分析，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，Masc

18、ot軟件搜索MSDP、SWISS2PROT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。結(jié)果獲得重復性和分辨率較好的脊髓雙向凝膠電泳圖譜。斑點數(shù)分別檢出268±13和301±15個蛋白點，對2張電泳圖進行匹配后發(fā)現(xiàn)有7個蛋白斑點在2組大鼠脊髓組織中含量發(fā)生了3倍以上的變化，有差異的7個蛋白斑點經(jīng)質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)檢索發(fā)現(xiàn)了3個差異表達蛋白質(zhì)。分別為glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(甘油三磷酸脫氫酶)、valosin-co

19、ntaining protein(含纈酪肽蛋白)和cytoplasmic2(Gamma-actin)(類肌動蛋白)。弓形蟲慢性感染對大鼠脊髓神經(jīng)損傷機制可能與能量代謝受阻和細胞增殖有關。差異蛋白點有可能成為弓形蟲慢性感染的治療靶點。
　　 綜上所述，慢性弓形蟲感染對實驗大鼠的學習記憶能力有一定程度的損害，其作用機制可能是弓形蟲感染后影響了大鼠海馬組織的細胞因子、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、海馬抗氧化水平以及蛋白差異表達等。其研究結(jié)果可為發(fā)現(xiàn)