弓形蟲緩殖子抗原SAG2C-2D-2X核酸疫苗及優(yōu)勢表位抗弓形蟲慢性感染的實驗研究.pdf

1、作為一種細胞內(nèi)寄生的機會致病性原蟲，在免疫功能正常的宿主體內(nèi)，弓形蟲速殖子增殖受到抑制即轉(zhuǎn)換為緩殖子，形成以包囊形式存在的慢性期感染。包囊可數(shù)年甚至終生存在眼和腦內(nèi)，引起相應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和不同程度的視力損害。緩殖子在宿主免疫功能下降或缺陷時，可重新活化增殖轉(zhuǎn)變?yōu)樗僦匙?，造成嚴重的臨床癥狀和后果，如包囊內(nèi)緩殖子的激活是艾滋病患者發(fā)病和死亡的一個重要原因。因此，預(yù)防或控制由包囊內(nèi)緩殖子引起的慢性感染有著極其重要的意義。
　　目前

2、，弓形蟲疫苗保護性抗原的研究大多數(shù)針對引起急性感染的速殖子期特異性表達抗原，對引起慢性感染的緩殖子期特異性表達抗原的研究則相對較少。SAG2C/2D/2X足剛地弓形蟲SAG2超家族的表面抗原，特異性表達在緩殖子時期，免疫熒光分析表明，SAG2C和/或SAG2D在速殖子-緩殖子轉(zhuǎn)換前即表達。研究發(fā)現(xiàn)，SAG2C/2D/2X在包囊長時間存在腦組織的機制中起到重要作用。然而，至今還未有對SAG2C/2D/2X作為抗弓形蟲病疫苗的潛力進行評估和

3、檢測的研究。因此，以緩殖子期特異性抗原SAG2C/2D/2X為靶抗原的弓形蟲核酸疫苗的研究對預(yù)防和控制弓形蟲慢性感染是非常重要的。
　　在本研究中，我們選擇弓形蟲緩殖子抗原SAG2C/2D/2X構(gòu)建核酸疫苗，并評估其誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答和抗弓形蟲包囊形成的保護能力。首先，體外擴增緩殖子抗原SAG2C/2D/2X基因，將其克隆入真核表達質(zhì)粒pVAX1構(gòu)建pVAX1-SAG2C(pSAG2C),pVAX1-SAG2D(pSAG2D)和p

4、VAX1-SAG2X(pSAG2X)核酸疫苗，然后將核酸疫苗經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠。結(jié)果表明，與對照組PBS和空載體pVAX1組相比，核酸疫苗免疫組小鼠可產(chǎn)生高滴度的抗弓形蟲抗體IgG(d35，p＜0.05)，特別是pSAG2C，pSAG2X及混合免疫組，IgG抗體滴度在末次免疫后4周增加明顯，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。ELISA法檢測小鼠脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子IL-2的水平在單基因核酸疫苗免疫組較對照組有顯著增加

5、(p＜0.05)，混合免疫組中檢測到最高量(486.3±79.1)pg/ml，與單基因組相比差異顯著(p＜0.01);流式細胞術(shù)分析免疫鼠CD8+T淋巴細胞產(chǎn)IFN-γ的水平，單基因核酸免疫組產(chǎn)IFN-γ的CD8+T淋巴細胞表達較對照組顯著增高(p＜0.05)，混合疫苗免疫組可檢測到最高比例的IFN-γ+/CD8+T雙染陽性的脾細胞，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。淋巴細胞增殖反應(yīng)也顯示，與對照組相比，單基因與混合基因免疫組小鼠的脾細

6、胞具有更高的細胞增殖活性(p＜0.05)。以上實驗數(shù)據(jù)表明，單基因及混合基因疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生主要以Th1型為主的細胞免疫反應(yīng)。
　　我們用Ⅱ型弓形蟲PRU株包囊進行攻擊實驗，評估SAG2C/2D/2X核酸疫苗的免疫保護作用。結(jié)果顯示，核酸疫苗免疫組小鼠腦包囊形成數(shù)量顯著減少，與PBS組相比其減少率分別為72％，23％和70％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。特別是pSAG2C/pSAG2D/pSAG2X混合免疫組，包囊減少率達

7、77％，免疫保護性優(yōu)于單基因免疫組(p＜0.01)。
　　我們進一步分析了蛋白SAG2C，SAG2D，SAG2X的結(jié)構(gòu)特性。氨基酸序列比對分數(shù)為98％，高度預(yù)示SAG2C/2D/2X為同源蛋白;在空間上，發(fā)現(xiàn)蛋白SAG2C/2D/2X的結(jié)構(gòu)域由多個β片層環(huán)繞而成，預(yù)測該結(jié)構(gòu)特點可能與蛋白功能相關(guān)。MHC（即H-2）限制性的CD8+T細胞表位肽免疫小鼠可有效刺激小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)及免疫保護作用。特別是表位肽TSTTKSVTF和QA

8、LVPNSSL能高效刺激小鼠記憶性T淋巴細胞增殖，可作為表位疫苗和靶向藥物的候選成分。
　　綜上所述，本課題通過對編碼弓形蟲緩殖子期特異性表達抗原SAG2C/2D/2X核酸疫苗及優(yōu)勢表位免疫BALB/c小鼠的實驗研究證實，緩殖子抗原SAG2C/2D/2X核酸疫苗可有效誘導(dǎo)免疫鼠產(chǎn)生體液及細胞免疫反應(yīng)，可有效抵抗弓形蟲包囊的攻擊，腦內(nèi)包囊形成數(shù)量顯著減少，且三種抗原基因混合免疫的效果要優(yōu)于單基因免疫。另外，篩選出的抗原優(yōu)勢表位免疫小