大麻素對(duì)HPV感染引起的宮頸癌的作用機(jī)制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立.pdf

1、研究背景與目的:
　　病毒（virus)由一個(gè)核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)（Protein）構(gòu)成或僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成。一般按遺傳物質(zhì)的不同可將病毒分為DNA病毒、RNA病毒和蛋白質(zhì)病毒，其中 DNA病毒只能感染一種動(dòng)物（個(gè)別例外）?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)病毒不但具有致病性，一些病毒也具有致癌性。目前的實(shí)驗(yàn)研究證明宮頸癌的發(fā)生與 HPV感染有關(guān)，肝癌的發(fā)生與HBV感染有關(guān)。宮頸癌已成為僅次于乳腺癌的常見婦女惡性腫瘤疾病。根據(jù)現(xiàn)有的的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2、，全球范圍內(nèi)的宮頸癌患者中每年的死亡人數(shù)將近20萬。每年有高達(dá)51萬的新發(fā)病例而中國每年的新發(fā)病例就超過10萬。與此同時(shí)，中國現(xiàn)有乙肝病毒攜帶者超過1億，其中每年因罹患肝癌死亡的人數(shù)約有30萬。在慢性肝炎患者中，一部分患者肝臟會(huì)發(fā)生肝纖維化，并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌。
　　大麻素是從印度大麻（Cannabis indica）里發(fā)現(xiàn)的一組萜酚類化合物，存在于動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。大麻素發(fā)生生物效應(yīng)的基礎(chǔ)是大麻素受體。研究發(fā)現(xiàn)，大

3、麻素對(duì)乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等具有抑制作用，在腫瘤組織中，增加大麻素受體在組織中的分泌可以選擇性抑制細(xì)胞的惡性增殖。另一些研究發(fā)現(xiàn)大麻素能夠影響HBV慢性感染的患者的肝組織病變進(jìn)程。
　　本研究旨在構(gòu)建 CB1/CB2基因真核表達(dá)載體，選取人腎胚細(xì)胞（HEK293）作為生物載體，研究大麻素的生物學(xué)特性；選取宮頸癌CaSki細(xì)胞系作為研究對(duì)象，研究大麻素對(duì)對(duì)宮頸癌凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制；利用 HBVcccDNA建立慢性乙型肝炎病

4、毒感染的小鼠模型，研究大麻素對(duì)肝炎肝組織病變進(jìn)程的影響及機(jī)制。為闡明CB基因的生物活性及其對(duì)宮頸癌的影響和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究CB基因?qū)BV引起的肝損傷可能的作用提供了動(dòng)物模型。
　　方法:
　　1.通過PCR擴(kuò)增獲取目的基因（cannabinoid receptor gene, CB基因）。
　　2.通過雙酶切，載體連接，感受態(tài)轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取等方法獲得CB基因真核表達(dá)載體，并通過雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。<

5、br>　　3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 CB基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入 HEK293細(xì)胞中，通過細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦方法檢測CB基因的表達(dá)及細(xì)胞定位。
　　4.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CB基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CaSki細(xì)胞中通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。
　　5.通過Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Bcl-2、Bax、Bad相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，研究CB基因?qū)m頸癌的作用機(jī)制。
　　6.通過PCR擴(kuò)增獲得HBV

6、基因，經(jīng)酶切、純化后環(huán)化等生物方法制備HBVcccDNA。
　　7.利用水動(dòng)力法尾靜脈注射HBVcccDNA至C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射后，分別于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w經(jīng)小鼠尾靜脈采集血清樣本；于第1w、3w、6w、10w經(jīng)頸椎脫臼處死后取肝組織。
　　8.利用放射免疫法檢測血清樣本中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒 e抗原（HBeAg）的濃度變化；熒光定

7、量PCR檢測血清和肝組織中HBV DNA拷貝數(shù)；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中HBsAg和HBcAg的表達(dá)；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理變化。
　　結(jié)果:
　　1. PCR產(chǎn)物電泳后分別得到rCB1（1.5Kb）、CB1（1.5Kb）、CB2（1.1Kb）片段。
　　2.雙酶切重組質(zhì)粒后電泳， pCDNA3.1(+)-CB1質(zhì)粒出現(xiàn)5.3 Kb和1.5 Kb兩條帶，GV230- CB1質(zhì)粒出現(xiàn)5.3 Kb和1.5

8、 Kb兩條條帶， GV230-CB2質(zhì)粒出現(xiàn)5.3 Kb和1.1Kb兩條帶。
　　3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦發(fā)現(xiàn)CB蛋白表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。
　　4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)CB轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率大于空白組的細(xì)胞凋亡率。
　　5.WB和qRT-PCR檢測Bcl-2、bad、bax凋亡因子發(fā)現(xiàn)CB轉(zhuǎn)染組的bad、bax表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2呈

9、下調(diào)。
　　6.PCR獲得3.2KbHBV片段， BspQⅠ酶切、純化、T4DNA連接酶連接后獲得環(huán)化的HBVcccDNA
　　7.放射免疫法檢測不同時(shí)間點(diǎn)的血清樣本，發(fā)現(xiàn) HBsAg、HBeAg在小鼠血清中均有表達(dá)均呈現(xiàn)四個(gè)上升-下降曲線；熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，HBV DNA拷貝數(shù)呈下降趨勢(shì)；免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)HBsAg、HBcAg在肝組織中表達(dá)；HE染色病理分析發(fā)小鼠肝臟出現(xiàn)肝臟細(xì)胞炎癥、肝細(xì)胞纖維化、