豬急慢性弓形蟲感染ELISA鑒別診斷方法的研究與初步應用.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由細胞內寄生原蟲龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii)引起的一種人獸共患病。弓形蟲病呈世界性分布，在人、家養(yǎng)動物和野生動物中廣泛傳播，據估計全球有超過1/3的人感染弓形蟲。弓形蟲感染一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，大多數(shù)被感染者可以終生攜帶組織包囊而不呈現(xiàn)任何臨床癥狀。然而，對一些免疫抑制病人，例如艾滋病人和惡性腫瘤患者，弓形蟲感染卻可以由慢性潛伏感染轉化為急性感染從而引起嚴重的后果，甚至威脅

2、患者的生命。人類感染弓形蟲主要因為通過食物和飲水攝入了孢子化卵囊或組織包囊，而豬肉正是組織包囊最重要的肉食性來源。中國是養(yǎng)豬業(yè)大國，同時也是豬肉消費大國。因此迫切需要一種方法能夠對攜帶組織包囊的牲豬進行快速的鑒別診斷，從而為弓形蟲病的預防和控制創(chuàng)造條件。
　　 本研究利用原核表達方法獲得了兩種重組蛋白，即緩殖子特異性蛋白BAG1和速殖子特異性蛋白SAG1，并建立了兩種間接ELISA方法rBAG1-間接ELISA和rSAG-間接E

3、LISA。使用這兩種間接ELISA方法并結合本實驗已經建立的rMIC3-間接ELISA方法，可以對弓形蟲慢性感染的豬進行很好的鑒別診斷。
　　 (1)通過RT-PCR擴增獲得了Pru株弓形蟲BAG1基因完整的CDS序列(690bp)，并構建了BAG1基因的原核表達質粒pET28a(+)-BAG1，實現(xiàn)了BAG1的原核表達，表達產物分子量約32kD，經Western-blot證實此表達產物能夠被特異的弓形蟲陽性豬血清識別，證明此原

4、核表達產物具有良好的免疫反應性。
　　 (2)通過PCR擴增獲得了RH株弓形蟲SAG1基因，并構建了SAG1基因部分序列(855bp)的原核表達質粒pET28a(+)-SAG1，實現(xiàn)了SAG1的原核表達，表達產物分子量約35kD，經Western-blot證實此原核表達產物能夠被特異的弓形蟲陽性豬血清識別，證明此原核表達產物具有良好的免疫反應性。
　　 (3)建立了rBAG1-間接ELISA方法，最佳蛋白濃度1:200，

5、最佳血清稀釋度1:100，最佳BSA濃度1.00%，最佳封閉時間30min，最佳血清作用時間30min，最佳二抗?jié)舛葹?:7000，最佳二抗作用時間60min，陰陽性臨界值為OD630=0.38。
　　 (4)構建了rSAG1-間接ELISA方法，最佳蛋白濃度1:200，最佳血清稀釋度1:100，最佳BSA濃度1.00%，最佳封閉時間60min，最佳血清作用時間30min，最佳二抗?jié)舛葹?:6000，最佳二抗作用時間60min，