檢測牛血清新孢子蟲和弓形蟲抗體間接ELISA的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究利用重組蛋白分別建立了檢測新孢子蟲抗體和弓形蟲抗體的間接ELISA方法，并對我國十個(gè)省(市)4個(gè)品種牛群的感染情況進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)查，為我國牛群新孢子蟲和弓形蟲感染的流行病學(xué)監(jiān)測、診斷提供有效手段。 原核表達(dá)的新孢子蟲NcSRS2和NcSRS2-SAGl蛋白經(jīng)0.5mmol/L IPFG誘導(dǎo)后4-6小時(shí)，重組蛋白表達(dá)量最高。Western-Blotting分析表明，重組蛋白可被新孢子蟲陽性血清所識別。分別用純化的新孢子

2、蟲重組蛋白NcSRS2和NcSRS2-SAGl作為抗原，建立了檢測新孢子蟲抗體的間接ELISA，并確定了間接ELISA的最佳工作條件。其中NcSRS2重組蛋白抗原的最適包被濃度為6gg/mI；最佳條件為4℃過夜包被；待檢血清的最適稀釋度為1:50；HRP．羊抗牛IgG的最適工作濃度為l:8000：封閉條件為5％馬血清37℃作用30min；血清樣本的陰陽性臨界值為0.2。與間接免疫熒光試驗(yàn)和商品化ELISA檢測試劑盒相比較，NcSRS2蛋

3、白具有較好的特異性和敏感性，更適于血清流行病學(xué)的調(diào)查。用NcSRS2間接ELISA對我國牛群進(jìn)行新孢子蟲血清流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，各地奶牛新孢子蟲抗體陽性率在3.6-52.7％之間，平均抗體陽性率為27.7％。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：新孢子蟲抗體陽性牛的流產(chǎn)幾率要高于抗體陰性牛，且由新孢子蟲引起的流產(chǎn)主要發(fā)生在妊娠中后期；新孢子蟲抗體陽性與牛的年齡和產(chǎn)胎次數(shù)沒有明顯關(guān)系；我國奶牛場已普遍存在新孢子蟲感染。牦牛血清中也檢測到新孢子蟲抗體，抗體陽性

4、率為2.22％，水牛和肉牛未檢測到新孢子蟲抗體。 從弓形蟲基因組DNA中克隆得到SAGl和GRA6基因片段，利用分子生物學(xué)軟件選出抗原性最強(qiáng)的部分，構(gòu)建pGEX-GRA6-SAGl重組質(zhì)粒，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。重組蛋白GRA6-SAGl經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后6小時(shí)，表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的25％，分子量約為57KDa。經(jīng)Western-Blotting檢測，能被弓形蟲陽性血清所識別。以純化的弓形蟲重組蛋白GR

5、A6-SAGl作為抗原，建立了檢測弓形蟲抗體的間接ELISA，并確定了重組蛋白抗原的最適包被濃度為10μg/mL；最佳條件為37℃作用2h后4℃包被過夜；待檢血清的最適稀釋度為1:25；HRP．羊抗牛IgG的最適工作濃度為1:4000；封閉條件為10％馬血清37℃作用1.5h；血清樣本的陰陽性臨界值為0．2。阻斷試驗(yàn)、交叉反應(yīng)試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)以及與IHA比較試驗(yàn)表明，該方法具有較好的特異性和敏感性。牛弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我