器官發(fā)生與體細胞胚胎發(fā)生

1、器官發(fā)生與體細胞胚胎發(fā)生,,器官發(fā)生與體細胞胚胎發(fā)生,一．器官發(fā)生（一）概念：離體培養(yǎng)的組織、細胞在誘導條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。（二）發(fā)生方式：有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。,二）胚狀體方式(somatic embryo)

2、指由培養(yǎng)細胞誘導分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進而長成完整植株。由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個不同發(fā)育階段：1)外植體細胞脫分化。外植體發(fā)生細胞分裂，或進而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成 在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子進一步發(fā)育成胚。但在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過程是：細胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進而成為成熟

3、的有機體。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。,由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個不同發(fā)育階段：1)外植體細胞脫分化。外植體發(fā)生細胞分裂，或進而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成 在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子進一步發(fā)育成胚。在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過程類似

4、于合子胚的發(fā)育：細胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進而成為成熟的有機體。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。,,,,,胚狀體與不定芽的區(qū)別,胚狀體在組織學上具備以下和不定芽不同的三個特征：①最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方

5、向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。②胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。③胚狀體的維管組織的分布是獨立的“v”字形，而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。 胚狀體也是植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生最常見而重要的方式，它較不定芽方式有更多的優(yōu)點：如胚狀體產(chǎn)生偽數(shù)量比不定芽多；胚狀體可制成人工種子，便于運輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳

6、性更接近母體植株。這些對組織培養(yǎng)應用于育種是十分有利而重要的。,胚狀體與合子胚的比較,（三）影響體細胞胚胎發(fā)生的因素,1．生長調(diào)節(jié)物質(zhì),（1）生長素類：我們以離體培養(yǎng)條件下胡蘿卜的體細胞胚胎發(fā)生的誘導過程來進行分析（教程P99），在離體條件下胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程，每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)基），通常所用的生長素是2，4-D，濃度范圍0.5—1mg/

7、L。在這樣一種培養(yǎng)上，愈傷組織的若干部位分化形成分生細胞團，稱作“胚性細胞團”。在增殖培養(yǎng)基上反復繼代，胚性細胞團的數(shù)量不斷增加，但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而，如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)（成胚培養(yǎng)基）上，它們就能發(fā)育為成熟的胚?？磥?，在增殖培養(yǎng)基中生長素的存在，對于胚性細胞團后來在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少的。邊疆保存在無生長素培養(yǎng)基中的愈傷組織不能形成胚。在這個意義上，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細胞胚胎

8、發(fā)生的：誘導培養(yǎng)基：，而把每個胚性細胞團看成是一個無結(jié)構(gòu)的胚。,（2）細胞分裂素類：細胞分裂素對于體細胞胚胎發(fā)生的作用有相反的結(jié)論，既或促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生，這主要取決于植物的種類及其基因型。一般而言，細胞分裂素對于促進體細胞胚的成熟有顯著作用，特別有利于子葉的發(fā)育。另外有研究表明，不同的外植體對于細胞分裂素的需要可能具有不同的專一性，如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然BAP和激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用，但濃度為0.1μmol/

9、L的玉米素卻能促進這個過程，而BA對胡蘿卜則是促進其愈傷組織的增殖，但不形成胚性愈傷組織。,（3）赤霉素類：赤霉素類能抑制體細胞胚胎發(fā)生，但對于許多植物而言，赤霉素對于體細胞胚胎的成熟與萌發(fā)有促進作用。（4）脫落酸：抑制劑特別是ABA，在體細胞胚胎發(fā)生過程中的作用正逐漸被提示出來，ABA是一種天然產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)劑，當把無抑制作用劑量（通常是0.1~1μM）的ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時，可以允許胚成熟過程進行。但是其抑制異常增殖，包

10、括不定胚的啟動。另一方面抑制早熟萌發(fā)。,2．氮源氮源的形態(tài)有還原態(tài)氮（NH4+）和氧化態(tài)氮（NO3—）兩種。在以KNO3為唯一氮源（如White培養(yǎng)基）的培養(yǎng)上建立起來的愈傷組織，去掉生長素以后不能形成胚。然而是，若在培養(yǎng)基中加入少量NH4Cl即可明顯促進胚狀體的發(fā)育，上述結(jié)論是否說明，胚胎發(fā)生過程中還原態(tài)氮是必需的？我們可以對以下的實驗進行分析。,Reinert及基合作者在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中( 培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到

11、以下結(jié)果： [NH4+—氮]（M） [NO3——氮] （M） 體胚發(fā)生數(shù)（個/2ml）10 40 1131±2190 55 19±0.30 95 11.

12、3±4.1 從上表可以分析得出，盡管高濃度的氧化態(tài)氮同樣可以誘導體細胞胚胎發(fā)生，但是其誘導率遠遠低于還原態(tài)氮和氧化態(tài)氮配合使用時的誘導率。,三．長期培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力的喪失,有些愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物起初具有器官發(fā)生或胚胎發(fā)生的潛力，但經(jīng)過反復繼代保存之后喧種形態(tài)發(fā)生能力常常逐漸下降，有些甚至完全損失。為了解釋這種現(xiàn)象，現(xiàn)在有三種假說。,1．遺傳說 該假說認為，形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是由于在培養(yǎng)細胞中的核的特性發(fā)生了改變，

13、即細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過程中由于變異等原因而發(fā)生了改變或是突變。因此，可以推知，由這種原因所造成的形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是不可逆的。,2．生理說 從前面體細胞胚胎發(fā)生中的甜橙的馴化組織的形成的實例中，不難分析，隨著不斷的培養(yǎng)繼代的進行，培養(yǎng)組織或細胞中的內(nèi)源激素平衡關系可能會發(fā)生改變，而導致不能形態(tài)發(fā)生。在這種情況下，細胞雖然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，如果改變外部處理條件，應該有

14、可能使細胞的這種內(nèi)在潛力得到恢復。,3．競爭說 這個假說本質(zhì)上是前兩個假說的結(jié)合。按照這個假說的倡議者Smith 和Street（1974）的看法，在胡蘿卜細胞長其連續(xù)繼代培養(yǎng)基間，有兩個過程可能與胚胎發(fā)生能力的下降以至最終的喪失有關。首先，細胞對于生長素（2，4-D）抑制全能性表達的作用變得比較敏感；基次，隨著時間的推移，由于培養(yǎng)細胞在細胞學上的不穩(wěn)定性，出現(xiàn)了缺乏胚性潛力的新的細胞系，這些細胞學上的變化不一定是

15、染色體數(shù)目的變化，而可能只是遺傳信息的小的突變、丟失或易位，實際上，Jones（1974）已經(jīng)證實，在胡蘿卜培養(yǎng)物中，細胞群體在成胚能力上的不穩(wěn)定性，可能是由用于建立該培養(yǎng)物的組織帶來的。在復雜的多細胞外植體中，只有少數(shù)細胞能夠產(chǎn)生胚性細胞團，其余細胞都是無法表達其全能性的。按照這種假說，如果非胚性的細胞類型在所用的培養(yǎng)基中具有生長上的選擇優(yōu)勢，在反復的繼代培養(yǎng)中，非胚性細胞的群體將會愛步增加，而胚性成分則逐漸減少。到了一定時期之后，在

16、培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細胞，這時若想再恢復它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。然而，如果在培養(yǎng)物中存在少量胚性細胞，只是由于處在支配地位的非胚性細胞的抑制作用，這些胚性細胞的全能性無法表達，在這種情況下，通過改變培養(yǎng)基成分，使之有選擇地促進全能細胞的增殖，就應當有可能恢復該培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生潛力。,快速繁殖與脫毒培養(yǎng)第一節(jié) 快速繁殖（微繁殖）,概念：所謂快速繁殖，就是得用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織在人工控制的適宜條件下，迅速

17、擴大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。特點：繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時省工；節(jié)約空間有利于植物的工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進行，不受病蟲害侵害。主要適用于（1）加速某些難繁或繁殖速度低的植物，特別是一些珍稀名貴的花卉，需要發(fā)展的瀕危植物的繁殖。（2）用有性繁殖的方法難以保持品種特性的異花授粉植物，如油棕、獼猴桃、非洲菊等。（3）需要去除病毒的植物。（4）原種很少，生產(chǎn)上又急需推廣的植物。,快速繁殖過程,快

18、速繁殖過程一般包括四個階段，即無菌培養(yǎng)物的建立、芽的增殖、誘導生根和試管苗的移植。,1．外植體的選擇 選擇適當?shù)耐庵搀w對于快速繁殖能否成功是極其重要的，而選擇什么樣的外植體首先決定于第二階段芽的增殖所采用的途徑。,通過腋芽的形成來增加芽的數(shù)量時，應從帶有營養(yǎng)芽的部分得到外植體，并注意以下問題。（1）外植體大小，如為一般繁殖而非脫毒繁殖，可使用普通莖尖、芽或帶芽的莖切段作為外植體。（2）取材植株的生理狀態(tài)對培養(yǎng)成敗是極重要的，一般在植物

19、開始生長，芽已膨大但芽鱗片還未張開時最為合適，此時芽生長旺盛，并有芽鱗片的保護，不易污染。為了避免季節(jié)的影響，在有條件時也可以將植物放在光、溫條件穩(wěn)定的人工氣候箱或溫室中，使植物保持營養(yǎng)生長狀態(tài)，對某些需低溫或高溫或特殊光周期處理才能打破休眠的塊莖、鱗莖、球莖等，常要處理后才可剝?nèi)∏o尖進行培養(yǎng)。（3）芽在植物株上的部位也是需要注意的，在一些草本植物（如菊花等）中，使用頂芽或上部的芽作為分生組織或莖尖培養(yǎng)時的成功率常比側(cè)芽或基部的芽要高，

20、這可能和它們生長較旺盛有產(chǎn)。（4）多年生的木本植物隨著年齡的增加，分生組織、莖尖和芽的培養(yǎng)越困難，特別是成年樹較幼態(tài)樹的培養(yǎng)要困難得多，此時，常使用部分返幼階段或年齡較低的根蘗苗或不定芽做材料，或采取某些措施如將芽接在實生苗上，修剪、保持高水平的水肥進行營養(yǎng)繁殖，或用細胞分裂素噴灑植株的方法等。,在通過不定芽途徑使芽增殖時，可以根據(jù)不同的植物采用不同的外植體，如根、莖、葉或花器官的各部分，在自然界中能夠產(chǎn)生不定芽的器官應當首先被采用，如

21、非洲紫羅蘭、秋海棠、大巖桐、落地生根等可用葉片，某些蘭花等可以用莖尖；很多種植物，特別是單子葉植物，可以作用花器官，如黃花菜、鳶尾等。 在使用體細胞胚胎發(fā)生途徑時，常使用胚分生組織或生殖器官作為外植體,2．外植體的消毒,（三）芽的誘導及擴大化繁殖（增殖）這是快繁技術中最重要性一環(huán)，在這一階段潛在的植物體體（芽或胚狀體）通過腋芽的形成和生長、外植體或愈傷組織上不定芽的形成和胚狀體發(fā)生三條件途徑在數(shù)量上得迅速增殖，由于外植體種類的不同，

22、在增殖時可能采用的途徑不同。,1．    促進腋芽的形成和生長 在高等植物的每一個葉腋中通常都存在著腋芽，每一個腋芽在一定的條件下都能生長并形成一個枝條，項端優(yōu)勢可抑制腋芽生長，使用外源的細胞分裂素可以打破頂端優(yōu)勢，促進腋芽生長。在培養(yǎng)條件下，為了促使腋芽生長，需在培養(yǎng)基中加入一定濃度的合適種類的細胞分裂素，有時同時可加入少量的生長素以促進腋芽的生長（注意：生長素過多易導致愈傷化）。由于細胞分裂素的持續(xù)作用

23、，腋芽生長成枝條，新產(chǎn)生的枝條的腋芽在細胞分裂素的作用下又可生長，這樣反復數(shù)次就可以形成一叢嫩枝，將它們切割成帶有幾個芽的小塊接種到同樣的培養(yǎng)基上，這一過程又能重復進行，這樣就可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的芽。有些植物即使在含有細胞分裂素的培養(yǎng)基中其項端優(yōu)勢也不易被打破，接種的莖尖只能長成不分枝的一根枝條，此時可以用切段法（每個切段帶有一個腋芽）加以繁殖。用促進腋芽生長的方式進行增殖時，一般速度較其它兩種方法要慢些，但每經(jīng)一個流程，嫩枝就以

24、對數(shù)速度增長，并且由于莖尖的細胞是均一的二倍體，又不易受環(huán)境條件的影響而發(fā)生變異，所以遺傳的穩(wěn)定性較好，適用這種方法繁殖的植物種類也較多。,2．誘導不定芽的形成 從現(xiàn)存的芽之外的任何組織器官上通過器官發(fā)生行政機關后期怕芽稱為不定芽。通過不定芽形成途徑進行快繁，對于很多有貯藏器官的植物如百合、風信子等是很合適的，因為這些植物在自然條件下的營養(yǎng)繁殖速度一般不太快，而它的鱗片、葉基部或花梗等在培養(yǎng)時都容易產(chǎn)生不定芽或小鱗莖或小球莖等不定器官

25、，而且這一過程常可在試管中反復進行。不定芽也可以在愈傷組織上上產(chǎn)生，但如果經(jīng)過愈傷組織階段，特別是多次繼代的愈傷組織，不但器官發(fā)生的能力會逐漸降低以至完全喪失，而且后代的遺傳性不能穩(wěn)定，所以在快速繁殖中除少數(shù)作物外常不使用這種方法。對于不定芽的形成，除特殊情況外，一般都要在培養(yǎng)基中同時加入適當?shù)募毎至阉睾蜕L素。,3．誘導胚狀體的形成 在自然界只有少數(shù)植物可以通過體細胞胚胎發(fā)生而產(chǎn)生胚狀體，但在培養(yǎng)條件下，現(xiàn)在已知有30多個科、1

26、50多種植物可以產(chǎn)生胚狀體。誘導胚狀體時一般使用胚分生組織或生殖器官的組織作為外植體。在一個含有豐富還原態(tài)氮的基本培養(yǎng)基，在存在生長素，特別是2，4-D時誘導胚狀體的發(fā)生，然后轉(zhuǎn)移到降低濃度呀?jīng)]有生長素的培養(yǎng)基上使胚狀體成熟和生長。,通過胚狀體發(fā)生途徑可以在一個委小的容器中產(chǎn)生比前兩種增殖方法高得多的增殖速度，而且由于胚狀體是兩極性的可以免去誘導生根的步驟，加上它容易分散，可以減少前兩種增殖方法中因分離、切割、接種所需消耗的大量人力，有

27、利于將來實行機械化的操作。如果能夠控制好胚狀體發(fā)生和生長的同步性，誘導休眠和制造人工種子的技術無疑將是最理想的快速繁方法，但是目前除柑桔、棗椰、油棕和咖啡等少數(shù)作物外，這種方法使用并不普遍。這是因為很多重要的經(jīng)濟作物還不能誘導胚狀體的發(fā)生或者產(chǎn)生的胚狀體難以形成植株，或成苗率太低。另外遺傳性的變異和由胚狀體形成的植株的返幼（多年生植物的胚狀體長成的植株和實生苗一樣要經(jīng)過一個幼年期才能開花結(jié)果）也是重要的障礙。,（三）根的誘導這一階段的

28、目的是使第二階段通過腋芽生長和不定芽形成途徑得到的嫩枝生根產(chǎn)生小植株，以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困難些，其中從成年樹得到的材料就更困難。由于生長的嫩枝本身能全盛豐富的生長素，所以一部分植物可在無激素的培養(yǎng)基上生根。,1．剪下無根苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，試管苗的生根，對基本培養(yǎng)基的種類要求不嚴，如MS、B5、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導生根，但是其含鹽濃度要適當加以稀釋。前面的幾種培養(yǎng)基中，除Whi

29、te外，都富含N，P，K鹽，它們都抑制根的發(fā)生。因此，應將它們降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培養(yǎng)基適當加大生長素的濃度，不用或少用細胞分裂素，生長素濃度在0.1-10mg/l，使用較多的是NAA，其次為IAA和IBA，生長素濃度過高時容易引起愈傷組織化和抑制根的生長。培養(yǎng)基中蔗糖的濃度降低到1.0-1.5%，以增強植株的自養(yǎng)能力。培養(yǎng)基不宜過硬以免影響生根，可在培養(yǎng)基中加入1%左右的活性碳，為提高小植株的光合能力，可

30、將光強度增加到3000-10000lux，光周期可用24小時光照或16小時，8小時黑暗以利于光形成建成。,2．對較難誘導生根的植物，可先半無根苗浸泡在高濃度生長素（100mg/L）的無菌水中幾小時到1天，用無菌水洗凈生長素后再接種到生根培養(yǎng)基。對薔薇科的果樹如蘋果、梨等，可在生根培養(yǎng)基中加入適量的根皮苷或根皮酚（間苯三酚）以促進根的形成，濃度約150 mg/L，但也發(fā)現(xiàn)對一種李樹而PG加入后反而抑制根的形成，說明PG的刺激效應可能因基因

31、型而不同。3．嫁接到根系發(fā)達、抗逆性強的合適砧木上，如三倍體西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、飽和濕度條件下，三天傷口長出愈傷，一周可成活。,（四）移栽,植物無病毒苗的培育,一、病毒在植物上的危害 病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來的損失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)l0%-18%，為害馬鈴薯的病蟲害則更多，大約有幾卜種，田此，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴重障礙?；ɑ懿《镜奈：σ话銜绊懟?/p>

32、卉的觀賞價值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。 由于病毒對植物造成如此嚴重的危害。所以世界各國都開始重視這方面的研究，如日本用柑桔莖尖微嫁接繁殖無病毒柑桔營養(yǎng)系。美國用組織培養(yǎng)法，使蘋果無病毒苗已工廠化育苗，并在各國普遍開展。二、無病毒苗培育的意義 用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無毒苗，是一個積極有效的途徑，由于排除了使用藥劑，所以對減少污染，防止公害，保護環(huán)境都有積極的意義。,三、脫毒的方法

33、,（一） 熱處理脫毒,1．熱處理法的發(fā)現(xiàn)及應用 熱處理又稱溫治療法(theomtherapy)，原理是當植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時，組織內(nèi)部的病毒受熱之后部分或全部鈍化，在高溫下，不能生成或生成病毒很少，而破壞卻日趨嚴重，以致病毒含量不斷降低，這樣持續(xù)一段時間，病毒自行消滅，從而達到脫毒的目的。,(1)溫湯浸漬處理 適用于休眠器官、剪下的接穗或種植的材料，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行

34、，但易使材料受傷。(2)熱空氣處理 熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好，將生長的盆栽植株移入溫熱治療室(箱)內(nèi)，一般在35—40℃。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數(shù)月。熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒，因此熱處理需與其他方法配合應用，才可獲得良好的效果。,（二）莖尖培養(yǎng)脫毒,,1．莖尖培養(yǎng)脫毒原理 感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染

35、深度越低，生長點(約0.1～1.0mm區(qū)域)則幾乎不含或含病毒很少、這是因為分生區(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞不斷分裂和活躍的生長速度。在切取莖尖時越小越好，但太小則不易成活，過大又不能保證完全除去病毒。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個途徑。,莖尖培養(yǎng)方法 在進行脫毒培養(yǎng)時，由于微小的莖尖組織很難靠肉眼操作，因而需用帶有適當光

36、源的簡單解剖鏡(8—40倍)。除了在進行植物組織無菌培養(yǎng)一般工具外，還需要一套解剖刀。剝離莖尖時，應盡快接種，莖尖暴露的時間應當越短越好，以防莖尖變干。在切取外植體之前一般須對莖芽進行表面消毒。葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須在75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。 將接處好的莖尖置于22℃左右的溫度下。每天以16h 2000—30001x的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫和

37、短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同,（三） 其他途徑脫毒,1。愈傷組織培養(yǎng)脫毒 通過植物的器官和組織的培養(yǎng)去分分誘導產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長成小植株，可以得到無病毒苗。2．莖尖微體嫁接 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，

38、再從成年無病樹枝上切取0.4—1.0mm莖尖，在砧木上進行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。 許多化學藥品(包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗菌素等)對離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果。常用的藥品有：8—氮鳥嘌呤、2—硫脲嘧啶、殺稻瘟抗菌素、放線菌素D、慶大霉素等。例如，將100μg 2—硫脲嘧啶加入培養(yǎng)基可除去煙草愈傷組織中的PVY(馬鈴薯病毒)。,四． 病毒植物的鑒定,,（一）指示植物(indmatingplant)法

39、 利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法，就是枯斑和空斑的測定法。這種專門選用以產(chǎn)生局部病斑的寄主即為指示植物，又稱鑒別寄主。它只能鑒定靠汁液傳染的病毒。 指示植物法最早是美國的病毒學家Holmes 1929年發(fā)現(xiàn)的。他用感染TMV的昔通煙葉的粗汁液和少許金剛砂相混合，然后在煙葉子上摩擦2—3d后葉片止出現(xiàn)了局部壞死斑。在一定范圍內(nèi)，枯斑與侵染性病毒的濃度成正比。這種方法條件簡單，操作方便，故一直沿用至今，仍為一

40、種經(jīng)濟而有效的鑒定方法。枯斑法不能測出病毒總的核蛋白濃度，而只能測出病毒的相對感染力。 由于病毒的寄生范圍不同，所以應根據(jù)不同的病毒選擇適合的指示植物。此外還要求所選擇的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在較長的時期內(nèi)還能保持對病毒的敏感性和容易接種，而且在較廣的范圍內(nèi)具有同樣的反應。指示植物一般有兩種類型：一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，其病毒可擴展到植物非接種部位，通常沒有局部病斑；另一種是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)狀

41、病斑構(gòu)成。 木本多年生果樹植物及草莓等無性繁殖的草本植物用汁液接種法比較困難，所以通常采用嫁接接種的方法。植物作砧木，被鑒定植物作接穗，常用劈接法。,（二）抗血清(antisemm)鑒定法 用已知抗血清可以鑒定未知病毒的種類。這種抗血清就是高度專一性的試劑，這種方法特異性高，測定速度快，一般幾小時甚至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。,（三）電子顯微鏡(elecmc mic

42、roscope)檢查法 由于人的眼睛難以觀察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光學顯微鏡也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通過電子顯微鏡才能分辨0.5μm大小的病毒顆粒。這樣采用電子顯微鏡既可以直接觀察病毒，檢查出有無病毒存在，了解病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)，又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進的方法，但需一定的設備和技術。 這一方法的優(yōu)點是靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測定病毒。,（四）

43、酶聯(lián)免疫鑒定法(Enzyme linked immunity absorption assay ELISA) 酶聯(lián)免疫法是指采用酶標記抗原或抗體的定量測定法。將抗原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)標記的抗體，使待檢血清中與對應抗原的特異性抗體結(jié)合，最后用特殊分光光度計測定。此法是現(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法。,五． 無病毒植物的利用,,一、無病毒苗的保存繁殖 無病毒植

44、株并不是有額外的抗病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應很好地隔離與保存。 二、無病毒苗的利用 無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場所應隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地方，要較長時間才會感染。而在種植時間長、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內(nèi)就可以感染。一旦感染，便會影響產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。因此，應重新采用無病毒苗，以保證生產(chǎn)的質(zhì)量。三