器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生

1、器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生,,器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生,一．器官發(fā)生（一）概念：離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過(guò)程。（二）發(fā)生方式：有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過(guò)程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過(guò)程。,二）胚狀體方式(somatic embryo)

2、指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長(zhǎng)成完整植株。由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段：1)外植體細(xì)胞脫分化。外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成 在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子進(jìn)一步發(fā)育成胚。但在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過(guò)程是：細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過(guò)原胚期、球形胚期、心形胚期、魚(yú)雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟

3、的有機(jī)體。我們把由愈傷組織的類(lèi)似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過(guò)程而直接產(chǎn)生類(lèi)似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 在外觀(guān)上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。,由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段：1)外植體細(xì)胞脫分化。外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成 在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子進(jìn)一步發(fā)育成胚。在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過(guò)程類(lèi)似

4、于合子胚的發(fā)育：細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過(guò)原胚期、球形胚期、心形胚期、魚(yú)雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟的有機(jī)體。我們把由愈傷組織的類(lèi)似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過(guò)程而直接產(chǎn)生類(lèi)似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 在外觀(guān)上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。,,,,,胚狀體與不定芽的區(qū)別,胚狀體在組織學(xué)上具備以下和不定芽不同的三個(gè)特征：①最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方

5、向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。②胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無(wú)解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。③胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“v”字形，而不定芽的維管組織無(wú)此現(xiàn)象。 胚狀體也是植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生最常見(jiàn)而重要的方式，它較不定芽方式有更多的優(yōu)點(diǎn)：如胚狀體產(chǎn)生偽數(shù)量比不定芽多；胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳

6、性更接近母體植株。這些對(duì)組織培養(yǎng)應(yīng)用于育種是十分有利而重要的。,胚狀體與合子胚的比較,（三）影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素,1．生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì),（1）生長(zhǎng)素類(lèi)：我們以離體培養(yǎng)條件下胡蘿卜的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)過(guò)程來(lái)進(jìn)行分析（教程P99），在離體條件下胡蘿卜體細(xì)胞胚的發(fā)育是一個(gè)包括兩個(gè)步驟的過(guò)程，每個(gè)步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)基），通常所用的生長(zhǎng)素是2，4-D，濃度范圍0.5—1mg/

7、L。在這樣一種培養(yǎng)上，愈傷組織的若干部位分化形成分生細(xì)胞團(tuán)，稱(chēng)作“胚性細(xì)胞團(tuán)”。在增殖培養(yǎng)基上反復(fù)繼代，胚性細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量不斷增加，但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而，如果把胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到一種生長(zhǎng)素含量很低或完全沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)（成胚培養(yǎng)基）上，它們就能發(fā)育為成熟的胚?？磥?lái)，在增殖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素的存在，對(duì)于胚性細(xì)胞團(tuán)后來(lái)在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少的。邊疆保存在無(wú)生長(zhǎng)素培養(yǎng)基中的愈傷組織不能形成胚。在這個(gè)意義上，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細(xì)胞胚胎

8、發(fā)生的：誘導(dǎo)培養(yǎng)基：，而把每個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)看成是一個(gè)無(wú)結(jié)構(gòu)的胚。,（2）細(xì)胞分裂素類(lèi)：細(xì)胞分裂素對(duì)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的作用有相反的結(jié)論，既或促進(jìn)也可抑制體細(xì)胞胚的發(fā)生，這主要取決于植物的種類(lèi)及其基因型。一般而言，細(xì)胞分裂素對(duì)于促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟有顯著作用，特別有利于子葉的發(fā)育。另外有研究表明，不同的外植體對(duì)于細(xì)胞分裂素的需要可能具有不同的專(zhuān)一性，如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然BAP和激動(dòng)素對(duì)胚胎發(fā)生過(guò)程表現(xiàn)抑制作用，但濃度為0.1μmol/

9、L的玉米素卻能促進(jìn)這個(gè)過(guò)程，而B(niǎo)A對(duì)胡蘿卜則是促進(jìn)其愈傷組織的增殖，但不形成胚性愈傷組織。,（3）赤霉素類(lèi)：赤霉素類(lèi)能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但對(duì)于許多植物而言，赤霉素對(duì)于體細(xì)胞胚胎的成熟與萌發(fā)有促進(jìn)作用。（4）脫落酸：抑制劑特別是ABA，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的作用正逐漸被提示出來(lái)，ABA是一種天然產(chǎn)生的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，當(dāng)把無(wú)抑制作用劑量（通常是0.1~1μM）的ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時(shí)，可以允許胚成熟過(guò)程進(jìn)行。但是其抑制異常增殖，包

10、括不定胚的啟動(dòng)。另一方面抑制早熟萌發(fā)。,2．氮源氮源的形態(tài)有還原態(tài)氮（NH4+）和氧化態(tài)氮（NO3—）兩種。在以KNO3為唯一氮源（如White培養(yǎng)基）的培養(yǎng)上建立起來(lái)的愈傷組織，去掉生長(zhǎng)素以后不能形成胚。然而是，若在培養(yǎng)基中加入少量NH4Cl即可明顯促進(jìn)胚狀體的發(fā)育，上述結(jié)論是否說(shuō)明，胚胎發(fā)生過(guò)程中還原態(tài)氮是必需的？我們可以對(duì)以下的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。,Reinert及基合作者在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中( 培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到

11、以下結(jié)果： [NH4+—氮]（M） [NO3——氮] （M） 體胚發(fā)生數(shù)（個(gè)/2ml）10 40 1131±2190 55 19±0.30 95 11.

12、3±4.1 從上表可以分析得出，盡管高濃度的氧化態(tài)氮同樣可以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但是其誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于還原態(tài)氮和氧化態(tài)氮配合使用時(shí)的誘導(dǎo)率。,三．長(zhǎng)期培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力的喪失,有些愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物起初具有器官發(fā)生或胚胎發(fā)生的潛力，但經(jīng)過(guò)反復(fù)繼代保存之后喧種形態(tài)發(fā)生能力常常逐漸下降，有些甚至完全損失。為了解釋這種現(xiàn)象，現(xiàn)在有三種假說(shuō)。,1．遺傳說(shuō) 該假說(shuō)認(rèn)為，形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是由于在培養(yǎng)細(xì)胞中的核的特性發(fā)生了改變，

13、即細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過(guò)程中由于變異等原因而發(fā)生了改變或是突變。因此，可以推知，由這種原因所造成的形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是不可逆的。,2．生理說(shuō) 從前面體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的甜橙的馴化組織的形成的實(shí)例中，不難分析，隨著不斷的培養(yǎng)繼代的進(jìn)行，培養(yǎng)組織或細(xì)胞中的內(nèi)源激素平衡關(guān)系可能會(huì)發(fā)生改變，而導(dǎo)致不能形態(tài)發(fā)生。在這種情況下，細(xì)胞雖然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，如果改變外部處理?xiàng)l件，應(yīng)該有

14、可能使細(xì)胞的這種內(nèi)在潛力得到恢復(fù)。,3．競(jìng)爭(zhēng)說(shuō) 這個(gè)假說(shuō)本質(zhì)上是前兩個(gè)假說(shuō)的結(jié)合。按照這個(gè)假說(shuō)的倡議者Smith 和Street（1974）的看法，在胡蘿卜細(xì)胞長(zhǎng)其連續(xù)繼代培養(yǎng)基間，有兩個(gè)過(guò)程可能與胚胎發(fā)生能力的下降以至最終的喪失有關(guān)。首先，細(xì)胞對(duì)于生長(zhǎng)素（2，4-D）抑制全能性表達(dá)的作用變得比較敏感；基次，隨著時(shí)間的推移，由于培養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞學(xué)上的不穩(wěn)定性，出現(xiàn)了缺乏胚性潛力的新的細(xì)胞系，這些細(xì)胞學(xué)上的變化不一定是

15、染色體數(shù)目的變化，而可能只是遺傳信息的小的突變、丟失或易位，實(shí)際上，Jones（1974）已經(jīng)證實(shí)，在胡蘿卜培養(yǎng)物中，細(xì)胞群體在成胚能力上的不穩(wěn)定性，可能是由用于建立該培養(yǎng)物的組織帶來(lái)的。在復(fù)雜的多細(xì)胞外植體中，只有少數(shù)細(xì)胞能夠產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，其余細(xì)胞都是無(wú)法表達(dá)其全能性的。按照這種假說(shuō)，如果非胚性的細(xì)胞類(lèi)型在所用的培養(yǎng)基中具有生長(zhǎng)上的選擇優(yōu)勢(shì)，在反復(fù)的繼代培養(yǎng)中，非胚性細(xì)胞的群體將會(huì)愛(ài)步增加，而胚性成分則逐漸減少。到了一定時(shí)期之后，在

16、培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細(xì)胞，這時(shí)若想再恢復(fù)它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。然而，如果在培養(yǎng)物中存在少量胚性細(xì)胞，只是由于處在支配地位的非胚性細(xì)胞的抑制作用，這些胚性細(xì)胞的全能性無(wú)法表達(dá)，在這種情況下，通過(guò)改變培養(yǎng)基成分，使之有選擇地促進(jìn)全能細(xì)胞的增殖，就應(yīng)當(dāng)有可能恢復(fù)該培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生潛力。,快速繁殖與脫毒培養(yǎng)第一節(jié) 快速繁殖（微繁殖）,概念：所謂快速繁殖，就是得用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織在人工控制的適宜條件下，迅速

17、擴(kuò)大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。特點(diǎn)：繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時(shí)省工；節(jié)約空間有利于植物的工廠(chǎng)化生產(chǎn)；在無(wú)菌條件下進(jìn)行，不受病蟲(chóng)害侵害。主要適用于（1）加速某些難繁或繁殖速度低的植物，特別是一些珍稀名貴的花卉，需要發(fā)展的瀕危植物的繁殖。（2）用有性繁殖的方法難以保持品種特性的異花授粉植物，如油棕、獼猴桃、非洲菊等。（3）需要去除病毒的植物。（4）原種很少，生產(chǎn)上又急需推廣的植物。,快速繁殖過(guò)程,快

18、速繁殖過(guò)程一般包括四個(gè)階段，即無(wú)菌培養(yǎng)物的建立、芽的增殖、誘導(dǎo)生根和試管苗的移植。,1．外植體的選擇 選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w對(duì)于快速繁殖能否成功是極其重要的，而選擇什么樣的外植體首先決定于第二階段芽的增殖所采用的途徑。,通過(guò)腋芽的形成來(lái)增加芽的數(shù)量時(shí)，應(yīng)從帶有營(yíng)養(yǎng)芽的部分得到外植體，并注意以下問(wèn)題。（1）外植體大小，如為一般繁殖而非脫毒繁殖，可使用普通莖尖、芽或帶芽的莖切段作為外植體。（2）取材植株的生理狀態(tài)對(duì)培養(yǎng)成敗是極重要的，一般在植物

19、開(kāi)始生長(zhǎng)，芽已膨大但芽鱗片還未張開(kāi)時(shí)最為合適，此時(shí)芽生長(zhǎng)旺盛，并有芽鱗片的保護(hù)，不易污染。為了避免季節(jié)的影響，在有條件時(shí)也可以將植物放在光、溫條件穩(wěn)定的人工氣候箱或溫室中，使植物保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)某些需低溫或高溫或特殊光周期處理才能打破休眠的塊莖、鱗莖、球莖等，常要處理后才可剝?nèi)∏o尖進(jìn)行培養(yǎng)。（3）芽在植物株上的部位也是需要注意的，在一些草本植物（如菊花等）中，使用頂芽或上部的芽作為分生組織或莖尖培養(yǎng)時(shí)的成功率常比側(cè)芽或基部的芽要高，

20、這可能和它們生長(zhǎng)較旺盛有產(chǎn)。（4）多年生的木本植物隨著年齡的增加，分生組織、莖尖和芽的培養(yǎng)越困難，特別是成年樹(shù)較幼態(tài)樹(shù)的培養(yǎng)要困難得多，此時(shí)，常使用部分返幼階段或年齡較低的根蘗苗或不定芽做材料，或采取某些措施如將芽接在實(shí)生苗上，修剪、保持高水平的水肥進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，或用細(xì)胞分裂素噴灑植株的方法等。,在通過(guò)不定芽途徑使芽增殖時(shí)，可以根據(jù)不同的植物采用不同的外植體，如根、莖、葉或花器官的各部分，在自然界中能夠產(chǎn)生不定芽的器官應(yīng)當(dāng)首先被采用，如

21、非洲紫羅蘭、秋海棠、大巖桐、落地生根等可用葉片，某些蘭花等可以用莖尖；很多種植物，特別是單子葉植物，可以作用花器官，如黃花菜、鳶尾等。 在使用體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑時(shí)，常使用胚分生組織或生殖器官作為外植體,2．外植體的消毒,（三）芽的誘導(dǎo)及擴(kuò)大化繁殖（增殖）這是快繁技術(shù)中最重要性一環(huán)，在這一階段潛在的植物體體（芽或胚狀體）通過(guò)腋芽的形成和生長(zhǎng)、外植體或愈傷組織上不定芽的形成和胚狀體發(fā)生三條件途徑在數(shù)量上得迅速增殖，由于外植體種類(lèi)的不同，

22、在增殖時(shí)可能采用的途徑不同。,1．    促進(jìn)腋芽的形成和生長(zhǎng) 在高等植物的每一個(gè)葉腋中通常都存在著腋芽，每一個(gè)腋芽在一定的條件下都能生長(zhǎng)并形成一個(gè)枝條，項(xiàng)端優(yōu)勢(shì)可抑制腋芽生長(zhǎng)，使用外源的細(xì)胞分裂素可以打破頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件下，為了促使腋芽生長(zhǎng)，需在培養(yǎng)基中加入一定濃度的合適種類(lèi)的細(xì)胞分裂素，有時(shí)同時(shí)可加入少量的生長(zhǎng)素以促進(jìn)腋芽的生長(zhǎng)（注意：生長(zhǎng)素過(guò)多易導(dǎo)致愈傷化）。由于細(xì)胞分裂素的持續(xù)作用

23、，腋芽生長(zhǎng)成枝條，新產(chǎn)生的枝條的腋芽在細(xì)胞分裂素的作用下又可生長(zhǎng)，這樣反復(fù)數(shù)次就可以形成一叢嫩枝，將它們切割成帶有幾個(gè)芽的小塊接種到同樣的培養(yǎng)基上，這一過(guò)程又能重復(fù)進(jìn)行，這樣就可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的芽。有些植物即使在含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中其項(xiàng)端優(yōu)勢(shì)也不易被打破，接種的莖尖只能長(zhǎng)成不分枝的一根枝條，此時(shí)可以用切段法（每個(gè)切段帶有一個(gè)腋芽）加以繁殖。用促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)的方式進(jìn)行增殖時(shí)，一般速度較其它兩種方法要慢些，但每經(jīng)一個(gè)流程，嫩枝就以

24、對(duì)數(shù)速度增長(zhǎng)，并且由于莖尖的細(xì)胞是均一的二倍體，又不易受環(huán)境條件的影響而發(fā)生變異，所以遺傳的穩(wěn)定性較好，適用這種方法繁殖的植物種類(lèi)也較多。,2．誘導(dǎo)不定芽的形成 從現(xiàn)存的芽之外的任何組織器官上通過(guò)器官發(fā)生行政機(jī)關(guān)后期怕芽稱(chēng)為不定芽。通過(guò)不定芽形成途徑進(jìn)行快繁，對(duì)于很多有貯藏器官的植物如百合、風(fēng)信子等是很合適的，因?yàn)檫@些植物在自然條件下的營(yíng)養(yǎng)繁殖速度一般不太快，而它的鱗片、葉基部或花梗等在培養(yǎng)時(shí)都容易產(chǎn)生不定芽或小鱗莖或小球莖等不定器官

25、，而且這一過(guò)程常可在試管中反復(fù)進(jìn)行。不定芽也可以在愈傷組織上上產(chǎn)生，但如果經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，特別是多次繼代的愈傷組織，不但器官發(fā)生的能力會(huì)逐漸降低以至完全喪失，而且后代的遺傳性不能穩(wěn)定，所以在快速繁殖中除少數(shù)作物外常不使用這種方法。對(duì)于不定芽的形成，除特殊情況外，一般都要在培養(yǎng)基中同時(shí)加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。,3．誘導(dǎo)胚狀體的形成 在自然界只有少數(shù)植物可以通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生而產(chǎn)生胚狀體，但在培養(yǎng)條件下，現(xiàn)在已知有30多個(gè)科、1

26、50多種植物可以產(chǎn)生胚狀體。誘導(dǎo)胚狀體時(shí)一般使用胚分生組織或生殖器官的組織作為外植體。在一個(gè)含有豐富還原態(tài)氮的基本培養(yǎng)基，在存在生長(zhǎng)素，特別是2，4-D時(shí)誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生，然后轉(zhuǎn)移到降低濃度呀?jīng)]有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上使胚狀體成熟和生長(zhǎng)。,通過(guò)胚狀體發(fā)生途徑可以在一個(gè)委小的容器中產(chǎn)生比前兩種增殖方法高得多的增殖速度，而且由于胚狀體是兩極性的可以免去誘導(dǎo)生根的步驟，加上它容易分散，可以減少前兩種增殖方法中因分離、切割、接種所需消耗的大量人力，有

27、利于將來(lái)實(shí)行機(jī)械化的操作。如果能夠控制好胚狀體發(fā)生和生長(zhǎng)的同步性，誘導(dǎo)休眠和制造人工種子的技術(shù)無(wú)疑將是最理想的快速繁方法，但是目前除柑桔、棗椰、油棕和咖啡等少數(shù)作物外，這種方法使用并不普遍。這是因?yàn)楹芏嘀匾慕?jīng)濟(jì)作物還不能誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生或者產(chǎn)生的胚狀體難以形成植株，或成苗率太低。另外遺傳性的變異和由胚狀體形成的植株的返幼（多年生植物的胚狀體長(zhǎng)成的植株和實(shí)生苗一樣要經(jīng)過(guò)一個(gè)幼年期才能開(kāi)花結(jié)果）也是重要的障礙。,（三）根的誘導(dǎo)這一階段的

28、目的是使第二階段通過(guò)腋芽生長(zhǎng)和不定芽形成途徑得到的嫩枝生根產(chǎn)生小植株，以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困難些，其中從成年樹(shù)得到的材料就更困難。由于生長(zhǎng)的嫩枝本身能全盛豐富的生長(zhǎng)素，所以一部分植物可在無(wú)激素的培養(yǎng)基上生根。,1．剪下無(wú)根苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，試管苗的生根，對(duì)基本培養(yǎng)基的種類(lèi)要求不嚴(yán)，如MS、B5、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，但是其含鹽濃度要適當(dāng)加以稀釋。前面的幾種培養(yǎng)基中，除Whi

29、te外，都富含N，P，K鹽，它們都抑制根的發(fā)生。因此，應(yīng)將它們降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培養(yǎng)基適當(dāng)加大生長(zhǎng)素的濃度，不用或少用細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素濃度在0.1-10mg/l，使用較多的是NAA，其次為IAA和IBA，生長(zhǎng)素濃度過(guò)高時(shí)容易引起愈傷組織化和抑制根的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中蔗糖的濃度降低到1.0-1.5%，以增強(qiáng)植株的自養(yǎng)能力。培養(yǎng)基不宜過(guò)硬以免影響生根，可在培養(yǎng)基中加入1%左右的活性碳，為提高小植株的光合能力，可

30、將光強(qiáng)度增加到3000-10000lux，光周期可用24小時(shí)光照或16小時(shí)，8小時(shí)黑暗以利于光形成建成。,2．對(duì)較難誘導(dǎo)生根的植物，可先半無(wú)根苗浸泡在高濃度生長(zhǎng)素（100mg/L）的無(wú)菌水中幾小時(shí)到1天，用無(wú)菌水洗凈生長(zhǎng)素后再接種到生根培養(yǎng)基。對(duì)薔薇科的果樹(shù)如蘋(píng)果、梨等，可在生根培養(yǎng)基中加入適量的根皮苷或根皮酚（間苯三酚）以促進(jìn)根的形成，濃度約150 mg/L，但也發(fā)現(xiàn)對(duì)一種李樹(shù)而PG加入后反而抑制根的形成，說(shuō)明PG的刺激效應(yīng)可能因基因

31、型而不同。3．嫁接到根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)的合適砧木上，如三倍體西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、飽和濕度條件下，三天傷口長(zhǎng)出愈傷，一周可成活。,（四）移栽,植物無(wú)病毒苗的培育,一、病毒在植物上的危害 病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來(lái)的損失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)l0%-18%，為害馬鈴薯的病蟲(chóng)害則更多，大約有幾卜種，田此，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重障礙?；ɑ懿《镜奈：σ话銜?huì)影響花

32、卉的觀(guān)賞價(jià)值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。 由于病毒對(duì)植物造成如此嚴(yán)重的危害。所以世界各國(guó)都開(kāi)始重視這方面的研究，如日本用柑桔莖尖微嫁接繁殖無(wú)病毒柑桔營(yíng)養(yǎng)系。美國(guó)用組織培養(yǎng)法，使蘋(píng)果無(wú)病毒苗已工廠(chǎng)化育苗，并在各國(guó)普遍開(kāi)展。二、無(wú)病毒苗培育的意義 用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無(wú)毒苗，是一個(gè)積極有效的途徑，由于排除了使用藥劑，所以對(duì)減少污染，防止公害，保護(hù)環(huán)境都有積極的意義。,三、脫毒的方法

33、,（一） 熱處理脫毒,1．熱處理法的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用 熱處理又稱(chēng)溫治療法(theomtherapy)，原理是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時(shí)，組織內(nèi)部的病毒受熱之后部分或全部鈍化，在高溫下，不能生成或生成病毒很少，而破壞卻日趨嚴(yán)重，以致病毒含量不斷降低，這樣持續(xù)一段時(shí)間，病毒自行消滅，從而達(dá)到脫毒的目的。,(1)溫湯浸漬處理 適用于休眠器官、剪下的接穗或種植的材料，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時(shí)，方法簡(jiǎn)便易行

34、，但易使材料受傷。(2)熱空氣處理 熱空氣處理對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好，將生長(zhǎng)的盆栽植株移入溫?zé)嶂委熓?箱)內(nèi)，一般在35—40℃。處理時(shí)間因植物而異，短則幾十分鐘，長(zhǎng)可達(dá)數(shù)月。熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒，因此熱處理需與其他方法配合應(yīng)用，才可獲得良好的效果。,（二）莖尖培養(yǎng)脫毒,,1．莖尖培養(yǎng)脫毒原理 感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染

35、深度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)(約0.1～1.0mm區(qū)域)則幾乎不含或含病毒很少、這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)無(wú)維管束，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度。在切取莖尖時(shí)越小越好，但太小則不易成活，過(guò)大又不能保證完全除去病毒。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無(wú)病毒苗最廣泛和最重要的一個(gè)途徑。,莖尖培養(yǎng)方法 在進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時(shí)，由于微小的莖尖組織很難靠肉眼操作，因而需用帶有適當(dāng)光

36、源的簡(jiǎn)單解剖鏡(8—40倍)。除了在進(jìn)行植物組織無(wú)菌培養(yǎng)一般工具外，還需要一套解剖刀。剝離莖尖時(shí)，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露的時(shí)間應(yīng)當(dāng)越短越好，以防莖尖變干。在切取外植體之前一般須對(duì)莖芽進(jìn)行表面消毒。葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花，只須在75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。 將接處好的莖尖置于22℃左右的溫度下。每天以16h 2000—30001x的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫和

37、短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時(shí)間必須保證。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同,（三） 其他途徑脫毒,1。愈傷組織培養(yǎng)脫毒 通過(guò)植物的器官和組織的培養(yǎng)去分分誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無(wú)病毒苗。2．莖尖微體嫁接 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實(shí)生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，

38、再?gòu)某赡隉o(wú)病樹(shù)枝上切取0.4—1.0mm莖尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以獲得無(wú)病毒幼苗。 許多化學(xué)藥品(包括嘌呤、嘧啶類(lèi)似物、氨基酸、抗菌素等)對(duì)離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果。常用的藥品有：8—氮鳥(niǎo)嘌呤、2—硫脲嘧啶、殺稻瘟抗菌素、放線(xiàn)菌素D、慶大霉素等。例如，將100μg 2—硫脲嘧啶加入培養(yǎng)基可除去煙草愈傷組織中的PVY(馬鈴薯病毒)。,四． 病毒植物的鑒定,,（一）指示植物(indmatingplant)法

39、 利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類(lèi)的方法，就是枯斑和空斑的測(cè)定法。這種專(zhuān)門(mén)選用以產(chǎn)生局部病斑的寄主即為指示植物，又稱(chēng)鑒別寄主。它只能鑒定靠汁液傳染的病毒。 指示植物法最早是美國(guó)的病毒學(xué)家Holmes 1929年發(fā)現(xiàn)的。他用感染TMV的昔通煙葉的粗汁液和少許金剛砂相混合，然后在煙葉子上摩擦2—3d后葉片止出現(xiàn)了局部壞死斑。在一定范圍內(nèi)，枯斑與侵染性病毒的濃度成正比。這種方法條件簡(jiǎn)單，操作方便，故一直沿用至今，仍為一

40、種經(jīng)濟(jì)而有效的鑒定方法?？莅叻ú荒軠y(cè)出病毒總的核蛋白濃度，而只能測(cè)出病毒的相對(duì)感染力。 由于病毒的寄生范圍不同，所以應(yīng)根據(jù)不同的病毒選擇適合的指示植物。此外還要求所選擇的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在較長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)還能保持對(duì)病毒的敏感性和容易接種，而且在較廣的范圍內(nèi)具有同樣的反應(yīng)。指示植物一般有兩種類(lèi)型：一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，其病毒可擴(kuò)展到植物非接種部位，通常沒(méi)有局部病斑；另一種是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)狀

41、病斑構(gòu)成。 木本多年生果樹(shù)植物及草莓等無(wú)性繁殖的草本植物用汁液接種法比較困難，所以通常采用嫁接接種的方法。植物作砧木，被鑒定植物作接穗，常用劈接法。,（二）抗血清(antisemm)鑒定法 用已知抗血清可以鑒定未知病毒的種類(lèi)。這種抗血清就是高度專(zhuān)一性的試劑，這種方法特異性高，測(cè)定速度快，一般幾小時(shí)甚至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。,（三）電子顯微鏡(elecmc mic

42、roscope)檢查法 由于人的眼睛難以觀(guān)察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光學(xué)顯微鏡也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通過(guò)電子顯微鏡才能分辨0.5μm大小的病毒顆粒。這樣采用電子顯微鏡既可以直接觀(guān)察病毒，檢查出有無(wú)病毒存在，了解病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)，又可以鑒定病毒的種類(lèi)。這是一種較為先進(jìn)的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。 這一方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。,（四）

43、酶聯(lián)免疫鑒定法(Enzyme linked immunity absorption assay ELISA) 酶聯(lián)免疫法是指采用酶標(biāo)記抗原或抗體的定量測(cè)定法。將抗原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶(過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記的抗體，使待檢血清中與對(duì)應(yīng)抗原的特異性抗體結(jié)合，最后用特殊分光光度計(jì)測(cè)定。此法是現(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法。,五． 無(wú)病毒植物的利用,,一、無(wú)病毒苗的保存繁殖 無(wú)病毒植

44、株并不是有額外的抗病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無(wú)病毒苗，就應(yīng)很好地隔離與保存。 二、無(wú)病毒苗的利用 無(wú)病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場(chǎng)所應(yīng)隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地方，要較長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)感染。而在種植時(shí)間長(zhǎng)、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內(nèi)就可以感染。一旦感染，便會(huì)影響產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。因此，應(yīng)重新采用無(wú)病毒苗，以保證生產(chǎn)的質(zhì)量。三