實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌pantoeastewartiisubsp.stewartii的研究

1、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii）的研究姓名：漆艷香申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：肖啟明;朱水芳2003.6.1實(shí)時(shí)熒光P C R 檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌( [ ) c l l T [ O C ' d 。Y ≠洲d l ? t t i is u b s p 。f 蹦塒，i i i ) 的研究中文摘要玉米細(xì)菌性枯萎病是玉米上

2、的一種毀滅性的病害；尤其對(duì)甜玉米更甚，在嚴(yán)重情況下可造成顆粒無收。目前我國(guó)尚無正式分布的報(bào)道，是被我國(guó)列為禁止進(jìn)境一類檢疫性有害生物。在我國(guó)口岸的檢疫中，一直沿用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生理生化鑒定、噬菌體檢測(cè)、免疫熒光染色和致病性試驗(yàn)等檢驗(yàn)的方法。應(yīng)用該類方法耗時(shí)長(zhǎng)、效率和靈敏度均較低，且經(jīng)驗(yàn)性很強(qiáng)，又往往難以確定準(zhǔn)確的細(xì)菌種類，不適合口岸快速驗(yàn)放的要求，難以標(biāo)準(zhǔn)化和大規(guī)模的推廣應(yīng)用，這些也J 下是目前細(xì)菌病原缺乏標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的重要原因。建立

3、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法迫在眉睫、意義重大。本研究成功建立了玉米細(xì)菌性枯萎病菌檢測(cè)的T a q M a n 探針實(shí)時(shí)熒光P C R 檢測(cè)方法，且在國(guó)內(nèi)外未見相同方法報(bào)道。將玉米細(xì)菌性枯萎病菌1 6 Sr D N A 基因克隆測(cè)序，根據(jù)本細(xì)菌與其它細(xì)菌菌株1 6 Sr D N A 序列差異，設(shè)計(jì)出對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌具有穩(wěn)定點(diǎn)突變的特異性探針，除泛菌屬3 個(gè)種和歐氏菌屬3 個(gè)種外，還對(duì)假單胞菌屬1 個(gè)種，黃單胞菌屬1 個(gè)種，棒形桿菌屬1 個(gè)種

4、，短d , g N N1 個(gè)種以及5 種植原體進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光P C R 。結(jié)果表明，只有玉米細(xì)菌性枯萎病菌產(chǎn)生熒光，其他細(xì)菌和植原體都沒有熒光產(chǎn)生。且絕對(duì)靈敏度比凝膠電泳高1 0 0 倍，達(dá)到2 ．5 3 ×1 0 6 個(gè)陽性分子。檢測(cè)的靈敏度為1 0 4 C F U ／m L 的菌懸浮液，相當(dāng)于4 個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的基因，靈敏度高，也就是說，反應(yīng)體系C R a g 有2 個(gè)活細(xì)菌，實(shí)時(shí)熒光P C R 就能檢測(cè)到。相對(duì)靈敏度為1 0