桑細菌性枯萎病病原學及其致病機理研究.pdf

1、從2006夏，在浙江省臨安、桐廬等地的桑園發(fā)現(xiàn)一種嚴重的桑樹細菌性新病害--桑樹細菌性枯萎病，造成了嚴重的損失。本研究通過對引發(fā)病害的病原及其發(fā)病機理進行深入探討。在國內外首次發(fā)現(xiàn)了由腸桿菌引起桑樹“枯萎”的新證據(jù)。研究通過柯赫氏法則、多重鑒定方法證明了引起病害的病原菌為陰溝腸桿菌群Enterobacter cloacae complex。并通過對桑細菌枯萎病菌導入綠色熒光蛋白基因的方法，觀察了病原菌在植物體內的分布規(guī)律；應用脂肪酸特征

2、、基因間重復序列多態(tài)性和特殊基因序列遺傳多態(tài)性的比較，分析了病原菌的群體多態(tài)性特征。取得了以下主要研究結果：
　　 (1)從浙江省臨安和桐廬發(fā)的病重區(qū)分3次采樣共33份，分離到病原細菌98株。采用水培扦插和桑樹盆栽苗接種的方法對選取的6株代表性菌株的致病性測定表明，各菌都能單獨引起桑樹枝條產生葉片黃化、枯萎、落葉和枝條頂端壞死癥狀，能引起桑樹盆栽苗產生枯萎和維管束褐變癥狀，為典型的桑樹細菌性枯萎病病原菌。6株代表菌株經經典細菌學

3、、Biolog和脂肪酸鑒定為腸桿菌屬Enterobacter spp.；16S rDNA序列分析將6個菌株歸入序列相似性都高于97％的3個腸桿菌種中；最后通過rpoB基因序列分析將6個菌株分別定位到陰溝腸桿菌(E. cloacae)，阿氏腸桿菌（Easburiae）和一個新種（Enterobacter sp.），均屬于陰溝腸桿菌組群。
　　 (2)用電擊轉化的方法將帶有綠色熒光蛋白和熒光素酶gfp/luxAB雙標記基因的轉座載體

4、整合到?？菸≡璄nterobacter sp. R18-2中，篩選到一個高效表達GFP的標記菌R18-gfp-1。R18-gfp-1通過gfp基因的特異性引物擴增，菌落形態(tài)的觀察，流式細胞儀檢測菌體大小、形狀及熒光的表達量，以及16S rDNA序列分析證明的確為R18-2的衍生菌。外源基因的導入并不影響菌株的生長，而且標記菌的熒光表達量穩(wěn)定，證明gfp基因是整合在標記菌的基因組染色體上的。接種實驗表明，標記菌和原始菌對桑樹和番茄組織培

5、養(yǎng)苗都具有致病能力，但是標記菌引起的桑樹苗“枯萎”發(fā)病癥狀比對照晚了5-6天，表明外源基因的表達削弱了菌株的致病力表現(xiàn)，但是不影響菌株在寄主體內的定位增殖。共聚焦熒光顯微鏡觀察R18-gfp-1在植物根、莖、葉組織分布的情況表明，病原菌接種3天后，除了接種位點外，細菌最早在根部生長點和皮層的薄壁細胞中可觀察到，接種5天后，植物根莖的導管細胞可以清楚的觀察到大量發(fā)綠色熒光菌體的分布，但是植株葉片上檢測不到菌體的分布情況，推測病原菌引起植物

6、上部出現(xiàn)枯萎，可能是由于細菌堵塞導管，引起植物水分缺乏所致。
　　 (3)50株?？菸∧c桿菌組多態(tài)性分析結果表明，引起桑樹枯萎病的陰溝腸桿菌組群具有豐富的種群和基因遺傳多態(tài)性，通過Hsp60基因、ERIC-PCR和BOX-PCR序列多態(tài)性和rpoB基因序列聚類分為10個基因群，但是它們的多重遺傳結構與病原菌致病能力和致病范圍多態(tài)性之間不存在相關性。2種基因間重復序列擴增多態(tài)性( ERIC-PCR，BOX-PCR)和2個特殊基因

7、(Hsp60，rpoB)多態(tài)性都和菌株的來源相關，但是與菌株間的脂肪酸類型和致病能力方面不存在相關性。表明了控制腸桿菌細胞脂肪酸類型的基因和控制病原菌致病相關基因可能不存在于腸細菌基因間共有重復序列和BOX元件中，而控制細菌熱休克蛋白的基因和編碼RNA聚合酶β亞基的基因也與編碼細胞脂肪酸類型和致病性基因沒有直接關系。但是這4種基因遺傳多態(tài)性的研究可對腸桿菌的種下分化鑒定和推測病原菌的來源及其病害的傳播流行趨勢起到指導性作用。