ra序貫誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化及對(duì)4.1蛋白表達(dá)的影響

1、授 予單位代碼學(xué)號(hào)或 申請(qǐng) 號(hào)1 0 4 5 90 5 3 1 1 9 7 1級(jí) . 公開文學(xué) 論 大 位 州 學(xué) 鄭 士碩論 文 題 目:作 者 姓 名 :學(xué) 科 門 類 :專 業(yè) 名 稱 :導(dǎo) 師 姓 名 、職 稱 :RA 序 貫誘 導(dǎo) 小 鼠胚胎 干 細(xì)胞 向神 經(jīng) 細(xì)胞分 化 及 對(duì) 4.1 蛋 白表 達(dá) 的 影 響姜 媛 媛理 學(xué)生 理 學(xué)邢 瑩 教 授- . 翻昏 .創(chuàng)奮 口 . 產(chǎn)r ， ， 盆 口— 月矛 月矛 ，丫J干

2、 口 匡 月鄭州人學(xué) 2加8 屆碩 卜 學(xué)位論 文 中 文摘 要采用鄭州大學(xué)干細(xì)胞中心培育的小鼠胚胎干細(xì)胞系。 組織塊原代培養(yǎng)法制備小 鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (M E F) 。E SC s復(fù)蘇后直接接種到經(jīng)絲裂霉素C (M M C ) 處理 的M E F 上 ，使用 含 白血 病 抑 制 因子 (LIF) 的M E F 條件 化 培 養(yǎng)基 (C M ) 進(jìn) 行培養(yǎng)和傳代 。待 E sc s生長(zhǎng) 穩(wěn) 定 ， 以105 個(gè)/m 1 接 種 于培

3、養(yǎng) 皿 中 。分三 組 : (l) 對(duì)照 組 : 用E B 培養(yǎng)基重懸后貼壁培養(yǎng) ，不加入任何誘導(dǎo)劑 ，自然 分化 。(2) 4一 + 誘 導(dǎo)組 : 用E B 培 養(yǎng) 基 重懸 ，懸 浮 培 養(yǎng)4 d ，每2一 3 h搖 晃 1次 ，防止E B 貼 壁 ，第s d收 集細(xì) 胞 ，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (含 10一m oF LR A ) 重懸 ，接種至 明膠 包被 的培養(yǎng)皿 ，4 d后換為E B 培 養(yǎng) 基 繼續(xù) 培 養(yǎng) 。(3) RA 序 貫

4、誘 導(dǎo)組 : 用 誘 導(dǎo)培養(yǎng) 基 (含 10七m 。 比 RA 的E B培養(yǎng)基 ) 重懸 ，貼壁培養(yǎng)48 h后 ，每個(gè)培養(yǎng)皿加入3m l 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基 (含20叫 LbFo F 、20， 0B 27 、 10， 0N Z 的無(wú)血 清n M E 入 f F 12培 養(yǎng)基 ) 培 養(yǎng)Z d ，此 后 每 天加 入 l ml 神 經(jīng) 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 基 (含 2 % B 27 、 15 % F B S 的D M E M /F 12培 養(yǎng)

5、基 ) ，直到第7 d用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基 換液 ，繼續(xù)培養(yǎng) 。倒 置顯 微 鏡觀 察分化 過程 中細(xì) 胞形態(tài) : 免疫細(xì) 胞化 學(xué)法 檢測(cè) 分化 第 10 d各 組成 熟神 經(jīng) 元標(biāo) 志 性抗 原神經(jīng) 元特 異性烯 醇化酶 (N SE ) 和 星形膠質(zhì) 細(xì)胞 標(biāo) 志性 抗原膠質(zhì) 纖維酸性 蛋 白 (G FA P ) ，計(jì)算N SE 和G FA P 的陽(yáng)性細(xì)胞率 ; 認(rèn) 七 st em 一 bl ot檢 測(cè) 分化 前后4.IN 和4. IB

6、 的表 達(dá) 量 。結(jié)果 :倒置 顯 微鏡 下滋 養(yǎng)層 細(xì)胞 M E F 表現(xiàn) 為 100 % 融合 的貼壁 生長(zhǎng) 的梭 形細(xì) 胞 。分化前 E SC : 呈 圓形或橢 圓形克隆樣 生長(zhǎng) ，折光性強(qiáng) ，細(xì)胞排列緊密 。對(duì)照組 自然 分化 10 d 后 可 見 克 隆 團(tuán)邊 緣 幾 乎 均 為 圓 形 高亮 的上 皮 樣 細(xì) 胞 ，外 周 為 少 量 梭形細(xì)胞: 4一+誘導(dǎo)組分化第s d 貼壁 12 h 后即可見梭形細(xì)胞爬出: 分化第 10

7、 d神經(jīng)樣細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)并形成網(wǎng)絡(luò); R A 序貫誘導(dǎo)組分化第 s d 出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣改變 ，細(xì) 胞 突起 細(xì) 長(zhǎng) : 神 經(jīng) 元 樣 細(xì) 胞 逐 漸 增 多 ，分 化 第 7 d 呈 雙 極性 或 多 極 性 ，形成 網(wǎng)絡(luò) 。免疫 細(xì) 胞化 學(xué)法檢 測(cè) 分化 第 10 d 對(duì) 照組 、4-/ 4+ 誘 導(dǎo)組和 R A 序 貫誘 導(dǎo)組 的N S E 陽(yáng) 性 細(xì) 胞 率 分 別 是 11. 8 % 士 1. 8 % 、50 .6 % 士2.