快速檢測(cè)土壤中酞酸酯的免疫分析技術(shù)研究.pdf

1、酞酸酯（PAEs）又名鄰苯二甲酸酯，作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品中，具有持久性有機(jī)污染物（POPs）的特性，廣泛存在于大氣、水、土壤和生物等環(huán)境中。PAEs是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生類雌激素作用，阻止與動(dòng)物生殖和發(fā)育有關(guān)的激素的合成、分泌、貯存、運(yùn)輸、結(jié)合和清除等過程，干擾血液維持正常的激素水平，具有致癌性、致畸性和致突變性。1977年，美國(guó)環(huán)保署（USEPA）將6種PAEs類化合物列入重點(diǎn)控制污染物名單，包括鄰

2、苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DnOP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）；20世紀(jì)80年代，我國(guó)也將DMP、DBP、DnOP列入環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單。
　　我國(guó)是設(shè)施農(nóng)業(yè)種植面積最大的國(guó)家，設(shè)施模式以塑料大棚和地膜覆蓋為主。PAEs能夠從農(nóng)膜中釋放進(jìn)入土壤，加之破碎和廢棄的農(nóng)膜能夠在土壤中長(zhǎng)期存在，不僅破壞土壤結(jié)構(gòu)、

3、退化土壤功能，還會(huì)通過作物吸收影響農(nóng)產(chǎn)品安全，危害人體健康。因此，準(zhǔn)確測(cè)定土壤中PAEs的含量，對(duì)于保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、保證農(nóng)產(chǎn)品安全和保護(hù)人體健康都具有十分重要的意義。PAEs的測(cè)定方法在早期主要有比色法、滴定法和分光光度法等，但這些方法的靈敏度低，選擇性差。目前，一些儀器分析技術(shù)被應(yīng)用于PAEs檢測(cè)，主要包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等。盡管儀

4、器分析法的靈敏度和精密度高，但是它們存在樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣耗時(shí)、儀器昂貴和不能在線連續(xù)分析等問題，迫切需要發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、靈敏、可靠的檢測(cè)技術(shù)。
　　近年來，基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫分析方法成為研究熱點(diǎn)。以固相載體吸附抗原-抗體為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫分析法（ELISA），不需要昂貴的儀器，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)篩選和大量樣本的快速檢測(cè)中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物篩選和環(huán)境分析與監(jiān)測(cè)等領(lǐng)

5、域。針對(duì)PAEs的免疫檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開展了一些研究工作，建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析法、直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法、競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，但是這些方法的線性范圍較窄、靈敏度較低，制備的抗體只能識(shí)別單一PAEs，難以滿足同時(shí)檢測(cè)環(huán)境中多種PAEs的實(shí)際需要。為此，本文以美國(guó)環(huán)保署優(yōu)先監(jiān)測(cè)的6種PAEs、增塑劑中常用的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）和鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）為檢測(cè)對(duì)象，基于PAEs類化合物的共性結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)

6、并合成了2種半抗原，制備免疫原和包被原，研制抗PAEs的特異性抗體，建立檢測(cè)PAEs的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法（ic-ELISA）和光纖免疫傳感技術(shù)，并成功應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中PAEs的快速靈敏檢測(cè)，取得了如下主要研究成果：
　　1.以4-硝基鄰苯二甲酸為起始化合物，經(jīng)過酯化、還原和酰胺化等反應(yīng)，成功合成了檢測(cè)PAEs的2種半抗原（I和II），研制的人工抗原具有載體蛋白和半抗原的特征吸收峰，初步說明偶聯(lián)成功。兩種免疫原（半抗原I

7、-BSA和半抗原II-BSA）中蛋白濃度分別為4.28和5.35 mg·mL-1，包被原（半抗原I-OVA和半抗原II-OVA）中蛋白濃度分別為2.78和2.05 mg·mL-1。半抗原I、II與BSA的結(jié)合比分別為11:1和8.5:1，與OVA的結(jié)合比分別為6.5:1和4:1，通過薄層層析（TLC）、核磁共振氫譜（1HNMR）和質(zhì)譜表征，說明人工全抗原的成功合成。
　　2.用制備的人工抗原免疫新西蘭大白兔，獲得從A1和A2兔（以

8、半抗原I-BSA為免疫原）產(chǎn)生的抗體效價(jià)分別為1:12800和1:25600，B1和B2兔（以半抗原II-BSA為免疫原）產(chǎn)生的抗體效價(jià)分別為1:12800和1:12800?；贏2兔獲得的抗血清效價(jià)最高，進(jìn)一步純化該抗血清，獲得抗體中蛋白含量為2.959 mg·mL-1。
　　3.采用ic-ELISA法，優(yōu)化并獲得PAEs的最佳檢測(cè)條件：包被原濃度和抗血清的稀釋倍數(shù)分別為0.5μg·mL-1和1:3200，磷酸鹽緩沖溶液（PBS

9、）的pH和鹽濃度分別為7.4和0.01 mol·L-1，酶標(biāo)二抗稀釋度為1:2000，抗原和一抗反應(yīng)60 min， PAEs標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醇含量為10％。在最佳檢測(cè)條件下，以PAEs類化合物的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制結(jié)合率（B/B0）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，獲得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的檢出限分別為0.013、0.013、0.012、0.042、0.035、0.021、0.017和0.016

10、μg·L-1，抗體與8種PAEs的交叉反應(yīng)率分別為100%、83.84%、76.84%、35.77%、39.22%、44.01%、16.69%和26.51%，表明該抗體具有較寬的識(shí)別范圍；對(duì)DMP的IC50為17.12μg·L-1，線性范圍為0.08~363.9μg·L-1。對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在加標(biāo)水平為5、10和100μg·kg-1時(shí)，獲得的平均回收率為63.9%~103.6%，RSD<11.32%；GC-MS法的平均回

11、收率為68.3%~101.4%，RSD<10.39%，兩種方法取得了一致的結(jié)果。建立的ic-ELISA法拓展了PAEs檢測(cè)的線性范圍，檢出限明顯降低，簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，測(cè)定時(shí)間僅需4.5 h，并成功應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中PAEs的檢測(cè)。
　　4.構(gòu)建光纖倏逝波免疫傳感器，用Cy5.5 NHS酯標(biāo)記抗體，優(yōu)化并獲得PAEs的最佳檢測(cè)條件：包被原濃度為50μg·mL-1，PBS溶液的pH和鹽濃度分別為7.4和0.01 mol·L-1

12、，PAEs-抗體預(yù)反應(yīng)時(shí)間為5 min。在最佳檢測(cè)條件下，以PAEs類化合物的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制結(jié)合率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，獲得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的檢出限分別為0.147、0.153、0.148、0.342、0.337、0.285、0.317和0.156μg·L-1，抗體與8種PAEs的交叉反應(yīng)率分別為100%、71.94%、62.66%、31.14%、51.8%、42.85

13、%、16.63%和22.75%；對(duì)DMP的IC50為9.54μg·L-1，線性范圍為0.22~145μg·L-1。傳感器具有良好的穩(wěn)定性和再生性能，使用相同濃度的標(biāo)記抗體，探頭進(jìn)行60次檢測(cè)，響應(yīng)信號(hào)沒有明顯下降。對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在加標(biāo)水平為5、10和100μg·kg-1時(shí)，獲得的平均回收率為61.5%~106.7%，RSD<13.41%；GC-MS法的平均回收率為66.1%~104.5%，RSD<11.63%，兩種方法