蘇丹紅I免疫原的制備及其免疫學快速檢測技術研究.pdf

1、蘇丹紅Ⅰ（SudanI）即1-苯基偶氮-2-萘酚，是一種人工合成的脂溶性化工染料，并被證明是一種潛在的致癌物質，禁止作為食品染料添加在食品中。2003年5月，法國從印度進口的紅辣椒粉中檢出蘇丹紅Ⅰ，對此發(fā)出緊急通知。在中國，2005年2月至5月蘇丹紅Ⅰ不斷在各種食品中檢出，比如：雞腿、漢堡、辣泡菜和辣椒醬等，引起人們消費恐慌。隨著科學技術的發(fā)展和國家的重視，其檢測方法也不斷發(fā)展。目前已有電化學分析法、光譜法、色譜法、液相色譜-質譜聯用技

2、術、免疫分析技術等檢測方法。酶聯免疫吸附分析法（ELISA）是一種簡單、準確、快速的分析方法，具備靈敏度高、特異性強等特點，己廣泛應用于臨床醫(yī)學檢驗、生物分析、食品分析和環(huán)境分析等領域中。為了建立快速、靈敏的蘇丹紅Ⅰ殘留免疫學分析方法，本研究在分析蘇丹紅Ⅰ免疫學特性的基礎上，采用單克隆抗體技術制備了蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體，并組裝了間接競爭ELISA試劑盒。
　　本研究主要內容包括：⑴重氮化法合成蘇丹紅Ⅰ的結構類似物（CSDI），以活性

3、酯法將 CSDI與載體蛋白偶聯，制備BSA-CSDI免疫抗原與OVA-CSDI。并用紫外掃描（UV）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行鑒定。用 SudanI人工免疫抗原（BSA-SudanI）免疫BALB/c小鼠。間接ELISA測定多抗血清效價，阻斷ELISA鑒定其抑制價。動物免疫試驗結果顯示：3只小鼠血清效價均達到了1×1.28-4，且3號小鼠多抗血清抗SudanI的IC50為67ng/mL，表明成功獲得了高效價、特異性好、

4、親和力較高的鼠源抗 SudanI多抗血清，為 SudanI殘留免疫學檢測方法的建立奠定了基礎。⑵間接ELISA和間接競爭ELISA檢測法選擇細胞融合備用鼠；運用雜交瘤技術制備蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體（SudanImAb），并對單克隆抗體的效價、親和力、敏感性、特異性和亞型進行鑒定；體內誘生腹水法大量制備單克隆抗體。篩選出了6H6B1、6H6E6、6H6G10、6F12E2、6F12E5和6F12G2六株敏感特異的雜交瘤細胞；鑒定單抗亞型均為I

5、gG1；細胞培養(yǎng)上清間接 ELISA效價在1:6.4×102～1:1.28×103之間，6H6E6細胞株制作的腹水效價為1:6.6×105，蘇丹紅ImAb親和常數(Ka)為1.85×1010L/moL和1.94×1010L/moL，對蘇丹紅Ⅰ的 IC50為2ng/mL；與其它標準品無交叉反應。通過試驗獲得了高效價、敏感、特異的蘇丹紅ImAb，可用于動物性食品中蘇丹紅Ⅰ的殘留檢測的免疫學試驗。⑶根據酶聯免疫吸附試驗原理，應用蘇丹紅ImAb