發(fā)酵醋液中氨基甲酸乙酯免疫快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，又稱烏拉坦，天然存在于面包、酸牛奶、乳酪、醬油及酒精類飲料等發(fā)酵食品中，是發(fā)酵過程中不可避免的伴隨產(chǎn)物，同時(shí)它也是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病。目前食品中的氨基甲酸乙酯被認(rèn)為是繼黃曲霉毒素之后的又一個(gè)重要致癌物，因此研究EC快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文重點(diǎn)研究了氨基甲酸乙酯間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)。
　　采用戊二

2、醛法將EC分別與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)進(jìn)行偶聯(lián)，制備出人工抗原EC-BSA和包被抗原EC-OVA。將人工抗原EC-BSA與弗氏完全佐劑(或弗氏不完全佐劑)等量混合，乳化后采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)注射法，免疫健康的新西蘭大耳白兔，獲得了含有多克隆抗體EC的免疫血清。制備的血清經(jīng)純化后用間接ELISA法測(cè)得血清效價(jià)為1:2000。建立了EC間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)表明，在0.001 ng/ml-10000 ng/

3、ml范圍內(nèi)，IC50為7.39ng/ml，IC15為0.04 ng/ml。對(duì)氨基甲酸甲酯(MC)的交叉反應(yīng)率為37.16％，說明制備的抗體具有其特異性。在不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵醋液中加入EC標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用ELISA法測(cè)定,測(cè)得發(fā)酵時(shí)間為20天的發(fā)酵醋液中EC濃度為23 ng/ml,平均加標(biāo)回收率為82.83%。同時(shí)用HPLC-FLD法進(jìn)行比對(duì)，測(cè)得發(fā)酵時(shí)間為20天的發(fā)酵醋液中EC濃度為27 ug/L,平均加標(biāo)回收率為85%，說明樣品前處理方

4、法可行。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法實(shí)現(xiàn)了EC的快速定量檢測(cè)。
　　研究了膠體金標(biāo)記抗體的EC免疫快速檢測(cè)技術(shù)。采用檸檬酸三鈉還原法制備出直徑約為42 nm的膠體金溶液，將制備的膠體金溶液標(biāo)記EC抗體，得到金標(biāo)抗體。將EC-OVA點(diǎn)涂在NC膜上作為T帶，合理稀釋倍數(shù)的羊抗兔二抗點(diǎn)涂在NC膜上作為C帶，在T帶和C帶之間加入一定比例混合的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液和純化后的金標(biāo)抗體的混合液，讓包被原和EC標(biāo)準(zhǔn)溶液競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)抗體，以此制備