多西環(huán)素殘留免疫學快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、多西環(huán)素(Doxycycline,DOX)為四環(huán)素類抗生素(Tetracycline,TCs),,通常用來治療動物傳染病,還被用作飼料添加劑,以預防疾病和促進動物生長。在實際工作中,由于隨意加大使用劑量和不遵守休藥期,造成藥物在動物組織中殘留。四環(huán)素類藥物長期殘留在動物組織中,導致耐藥菌在人類之間傳播,嚴重損害人體健康。很多國家和國際組織通過建立動物性食品中獸藥殘留的有效檢測方法,來控制藥物殘留問題。如,我國和歐盟對DOX在動物組織中殘

2、留最高殘留限量(MRL)作了明確規(guī)定:肌肉、肝臟和腎臟的MRL分別為100μg/kg、300μg/kg和600μg/kg。為了控制獸藥殘留,保障人類健康,有必要建立一種快速、有效的殘留檢測方法對其殘留進行監(jiān)測。
　　 現(xiàn)有的DOX殘留檢測的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、高效薄層色譜(HPTLC)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、流動注射、熒光法分析和時間分辨熒光光譜分析方法。雖然高效液相和質(zhì)譜檢測

3、等儀器方法,在鑒定藥物種類和定量分析上表現(xiàn)出良好的性能,但由于其操作復雜、分析費用昂貴,而不適用于對大量樣品進行殘留篩選。免疫分析技術(shù)以其靈敏、特異、快速、簡便等優(yōu)點在藥物殘留檢測領(lǐng)域已被廣泛應用。目前,僅有TCs免疫學檢測技術(shù),檢測DOX免疫學檢測方法很不完善,因此開發(fā)一種能快速檢測DOX殘留的免疫學檢測方法,對其殘留篩選具有重要價值。
　　 本研究對DOX的免疫原性,人工抗原的合成、兔抗DOX多克隆抗體(Anti-DOXpA

4、b)和抗DOX單克隆抗體(Anti-DOX mAb)制備及其特性、ELISA方法確立及其性能測定、免疫膠體金試紙條(Test-strip)的研制及其性能測定、高效液相檢測方法和ELISA方法、Test-strip方法的等同性確證等進行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.免疫原和包被原的合成與鑒定
　　 用重氮法和混合酸酐法合成免疫原(DOX-PABA-BSA),包被原(DOX-PABA-OVA);用赫夫曼反應和重氮法合

5、成免疫原(DOX-BSA),包被原(DOX-OVA)。通過紅外(IR)掃描、紫外掃描(UV)和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定,證明免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)偶聯(lián)成功,其分子結(jié)合比分別為12.3:1和5.8:1。將免疫原DOX-PABA-BSA和DOX-BSA免疫小鼠后,對鼠抗血清(DOX pAb)的進行ELISA方法檢測,獲得了高效價、敏感、特異的抗DOX血清,并進一步證明免疫原和包被原偶聯(lián)成功。
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6、.抗DOX單克隆抗體和多克隆抗體的制備及免疫學特性鑒定
　　 按照不同免疫劑量和免疫間期,用免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)免疫新西蘭大白兔6只,免疫后獲得了Anti-DOX pAb,來自2＃免疫組的兔抗體(pAbⅡ),經(jīng)間接ELISA效價測定為1:3.2×105,半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.65μg/L,與TCs交叉反應率(CR％)較低,其中四環(huán)素(Tetracycline,TC)為2.34％,金霉素(C

7、hlortetracycline,CTC)為1.46％,和土霉素(Oxytetracycline,OTC)為5.07％,與其它化合物無CR。
　　 用免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)免疫Balb/c小鼠,應用細胞融合技術(shù),篩選出2.3/3A6、2.1/2F8、2.1/4H10共3株雜交瘤細胞。用細胞株2.3/3A6,體內(nèi)誘生腹水法制備腹水抗DOX單克隆抗體(Anti-DOX mAb)。間接ELISA法測定雜交瘤

8、細胞培養(yǎng)液上清和腹水的效價分別為1:1280和1:32000。競爭ELISA測得腹水中Anti-DOX mAb的IC50為36.19μg//L,與TCs的交叉反應很低(CR<0.3％)。雜交瘤細胞染色體數(shù)目為90～101條,平均96.5條,同種型為IgG1。
　　 3.ELISA方法的建立及性能考核
　　 應用免疫原DOX-PABA-BSA進行免疫產(chǎn)生Anti-DOX pAb,建立DOX殘留快速檢測間接競爭ELISA方法

9、,其檢測質(zhì)量性能較好,標準曲線呈S型,符合4參數(shù)logit曲線擬合,線性檢測范圍為2.5～80μg/L；在PBS、豬肌肉和豬肝臟基質(zhì)中,ELISA方法的IC50分別為10.65μg/L、16.46μg/kg(μg/L)和16.99μg/kg(μg/L),結(jié)果表明建立的ELISA方法受基質(zhì)影響不大；方法在不同基質(zhì)最低檢測限(LOD)為:豬肌肉LOD為2.65μg/kg,豬肝臟LOD為2.96μg/kg；ic-ELISA方法能夠檢測范圍為1

10、.79～80μg/L；豬肌肉的平均添加回收率分為88.24％～89.19％,豬肝為84.61％～85.54％;批內(nèi)變異系數(shù)為2.60％～13.17％,批間變異系數(shù)為8.61％～11.38％,方法的重復性好于其他檢測方法；Anti-DOX pAb與TC、CTC、OTC藥物交叉反應率分別為2.34％、1.46％、5.07％。實驗結(jié)果證明,ic-ELISA方法能夠檢測豬肌肉和豬肝臟樣品中的DOX殘留。
　　 4.免疫膠體金試紙條的研制

11、及性能測試
　　 依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatography assay,GICA)原理,應用Anti-DOX mAb研制DOX殘留快速檢測免疫金標試紙條(Test-strip)。Test-strip的標準曲線呈S型,符合4參數(shù)對數(shù)曲線擬合,機讀檢測限為11μg/L,目測檢測限為20μg/L；目測發(fā)現(xiàn)Test-strip與其他抗生素無交叉反應。
　　 5.ELISA和金標試紙條檢測方法與H

12、PLC確證的比較
　　 選擇12頭15 kg左右的長大二元雜交去勢健康仔豬,隨機分為6組,第一組為對照組,其它5組為試驗組。對照組飼喂不含任何抗菌藥物的飼料,試驗組以2.5 mg/kg體重劑量的DOX注射液在仔豬頸部肌內(nèi)注射,一日1次,連用4 d。給藥后于0 d、3 d、6 d、10 d、16 d隨機各宰殺一組豬2頭,快速采集肌肉、肝樣品,并進行ELISA、Test-strip和HPLC檢測。用ELISA方法和HPLC方法檢測組

13、織樣品,兩種方法檢測結(jié)果有很好的相關(guān)性。間接競爭ELISA、Test-strip和HPLC方法平行對豬肌肉和肝臟樣品進行測試,檢測結(jié)果3種方法有很好相關(guān)性,ELISA和Test-strip檢測方法準確可靠,適合于DOX殘留快速檢測。
　　 本研究首次應用Anti-DOX pAb建立ELISA方法和應用Anti-DOX mAb建立Test-strip的方法檢測DOX殘留,為其它獸藥小分子化合物的免疫學殘留分析提供了基礎(chǔ)。該方法靈敏