檉柳、星星草金屬硫蛋白基因克隆及生物學(xué)功能研究.pdf

1、我國(guó)土壤重金屬污染問題不斷惡化，亟待解決。深入研究植物的耐重金屬機(jī)理，克隆相關(guān)基因并利用基因工程技術(shù)提高植物對(duì)重金屬的抗性，是凈化污染土壤的一條有效途徑。金屬硫蛋白(metallothioncin，MT)是一類廣泛存在于生物中的低分子量，富含半胱氨酸可結(jié)合重金屬的蛋白質(zhì)，在土壤重金屬污染的治理中越來越引起人們的重視。 應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)從檉柳和星星草cDNA文庫(kù)中分別克隆了檉柳和星星草的 MT基因，對(duì)該基因編碼的MT進(jìn)行了蛋白質(zhì)

2、家族、疏水性、信號(hào)肽、等電點(diǎn)及分子量的預(yù)測(cè)，并選取了幾種植物的 MT 基因氨基酸序列進(jìn)行了多序列比對(duì)分析及分子進(jìn)化樹繪制，結(jié)果表明克隆的檉柳和星星草MT基因符合植物MT基因所具有的典型特征。 將從檉柳中克隆到的MT基因構(gòu)建到載體pROKⅡ上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得75株卡那霉素抗性苗，轉(zhuǎn)化率達(dá)到78％。選取10株長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行分析，PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性；對(duì)其中6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR-Sou

3、thern雜交和Northern雜交，結(jié)果均為陽性，證明外源基因已整合到煙草基因組中并得到表達(dá)。 將在檉柳和星星草中克隆到的MT基因分別連接到載體pROKⅡ上，構(gòu)建了檉柳和星星草MT基因雙價(jià)植物表達(dá)載體，對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得83株卡那霉素抗性苗，轉(zhuǎn)化率達(dá)到75％。選取10株長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行分析，PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性：對(duì)其中7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別用檉柳和星星草MT基因標(biāo)記的探針進(jìn)行PCR-Southern 雜交，結(jié)果均

4、為陽性；再?gòu)闹羞x取5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果均為陽性，證明外源基因已整合到煙草基因組中并得到表達(dá)。 對(duì)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵?、轉(zhuǎn)檉柳MT基因煙草和轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草T<,0>代組培苗進(jìn)行了重金屬Cd和Cu脅迫試驗(yàn)，測(cè)定并分析了各轉(zhuǎn)基因煙草及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵菝{迫后的生根率、增重和株高變化。結(jié)果顯示，T<,0>代轉(zhuǎn)基因煙草在不同濃度CdCl<,2>和CuSO<,4>脅迫條件下，生根率、增重和株高均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?/p>

5、煙草。在CdCl<,2>脅迫下，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵菽茉?00μmol·L<'-1>CdCl<,2>濃度下生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)檉柳MT基因煙草能在200μmol·L<'-1>CdCl<,2>濃度下生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草能在300μmol·L<'-1>CdCl<,2>濃度下生長(zhǎng)。在CuSO<,4>脅迫下，在75 μmol·L<'-1>CuSO<,4>濃度下，三者均能正常生長(zhǎng)；在150μmol·L<'-1>CuSO<,4>濃度下，對(duì)照煙草不能生

6、長(zhǎng)，轉(zhuǎn)檉柳MT基因煙草生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草大部分能正常生長(zhǎng)；在225μmol·L<'-1>CuSO<,4>濃度下，轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草不能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)量有所增加。試驗(yàn)表明，MT基因的導(dǎo)入提高了T<,0>代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)Cd和Cu的耐受力，其中轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)Cd的抗性要高于對(duì)Cu的抗性，并且轉(zhuǎn)雙價(jià)MT基因比轉(zhuǎn)單價(jià)MT基因更能提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)重金屬的耐受力。 將T<,0>代自交得到的轉(zhuǎn)基因煙草種子播種于含

7、100 mg/LKan的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后，對(duì)8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的綠白苗之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)檉柳MT基因煙草T<,1>-5、T<,1>-8和轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草T<,1>′-2、T<,1>′-3的綠色苗與白化苗分離規(guī)律基本符合(2<'2>-1):1；轉(zhuǎn)檉柳MT因煙草T<,1>-6和轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草T<,1>′-9株系的綠色苗與白化苗分離規(guī)律基本符合(2<'4>-1):1。 對(duì)8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系卡那霉素抗性植株

8、進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陽性，初步證明了MT基因仍整合在煙草子一代基因組中。 對(duì)8個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系子一代(T<,1>)進(jìn)行了Cd脅迫試驗(yàn)，測(cè)定并分析了CdCl<,2>脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)量的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草T<,1>代組培苗在根長(zhǎng)、根數(shù)、苗增重、葉片數(shù)方面均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵?。轉(zhuǎn)檉柳MT基因煙草能夠在CdCl<,2>濃度為100μmol-L<'-1>培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，平均增重是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.07倍，平均根長(zhǎng)是非轉(zhuǎn)

9、基因?qū)φ盏?.96倍；轉(zhuǎn)檉柳、星星草MT基因煙草能夠在CdCl<,2>濃度為200μmol-L<'-1>培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，平均增重是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.85倍，平均根長(zhǎng)是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.74倍；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵菰贑dCl<,2>濃度為100μmol-L<'-1>時(shí)就表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，根系受到明顯抑制。試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)雙價(jià)MT基因煙草比轉(zhuǎn)單價(jià)MT基因煙草具有更強(qiáng)的Cd抗性。證明了外源MT基因可以在煙草子一代中遺傳，該基因的表達(dá)提高了煙草對(duì)Cd脅迫的