囊泡法轉(zhuǎn)染山羊重組FSH在巴斯德畢赤酵母中的優(yōu)化表達(dá)效應(yīng)的研究.pdf

1、促卵泡索(FSH)是一種對(duì)配子的發(fā)生、分化、成熟及與生殖有關(guān)行為的發(fā)生起重要作用的糖蛋白激素。應(yīng)用基因工程技術(shù)得到的重組FSH可避免天然激素制劑在應(yīng)用過(guò)程中的不足，為FSH的高效、廣泛地應(yīng)用帶來(lái)了契機(jī)。
　　 一個(gè)理想的載體對(duì)重組FSH轉(zhuǎn)染至巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中至關(guān)重要。非病毒類載體由于其較高的安全性能、易于大量制備合成、可以傳遞大片段DNA等優(yōu)點(diǎn)被廣泛運(yùn)用，但是非病毒類載體目前面臨最大的問(wèn)題是轉(zhuǎn)染效率低下，影響轉(zhuǎn)染效率的因素有

2、很多，其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體種類和DNA與脂質(zhì)體電荷比是兩大關(guān)鍵因素，調(diào)控優(yōu)化這兩個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)設(shè)計(jì)高轉(zhuǎn)染效率的非病毒類載體意義重大。
　　 本實(shí)驗(yàn)用限制性內(nèi)切酶SalⅠ單酶切質(zhì)粒pPIC9K/EGFP-FSHβ-CTP-α，利用所得的線性質(zhì)粒與陽(yáng)離子表面活性劑構(gòu)成復(fù)配體系，誘使表面活性劑聚集形成“DNA/表面活性劑”囊泡應(yīng)用于基因傳遞。通過(guò)采用不同陽(yáng)離子表面活性劑CTAB、DTAB、DEAB和不同DNA/陽(yáng)離子表面活性劑比例1∶0.0

3、08、1∶0.3、1∶1.4、1∶4、1∶7.2、1∶18、1∶40分別轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母，并與傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)化方法和商品化轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Sofast比較，通過(guò)對(duì)比不同DNA/表面活性劑囊泡，不同電荷比，不同轉(zhuǎn)染方式的目的蛋白FSHβ-CTP-α的表達(dá)量來(lái)研究重組FSH基因功能表達(dá)與轉(zhuǎn)染方式的關(guān)系，確定最優(yōu)化表達(dá)的脂質(zhì)體種類以及陽(yáng)離子脂質(zhì)體與重組FSH的最優(yōu)比例，為巴斯德畢赤酵母表達(dá)生物活性山羊重組FSH及

4、商業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　 1、利用三種不同陽(yáng)離子表面活性劑CTAB、DTAB、DEAB與線性載體pPIC9K/EGFP-FSHβ-CTP-α構(gòu)成復(fù)配體系，進(jìn)一步證明DNA可誘導(dǎo)陽(yáng)離子表面活性劑形成囊泡，可運(yùn)用于目的基因傳遞；
　　 2、表面活性劑的碳鏈長(zhǎng)度、疏水頭基不一樣伴隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的不一致；隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，表面活性劑的轉(zhuǎn)染效率隨之降低；在相同碳鏈長(zhǎng)度的情況下，親水頭基為甲基的表

5、面活性劑轉(zhuǎn)染效率相對(duì)親水頭基為乙基的表面活性劑高；
　　 3、DNA/表面活性劑不同電荷也伴隨著不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；在巴斯德畢赤酵母體系中，CTAB、DTAB、DEAB的最優(yōu)電荷比均是1∶7.2，轉(zhuǎn)染效率最高；過(guò)低電荷比1∶0.008和過(guò)高電荷比1∶18、1∶40均對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生不利影響；
　　 4、通過(guò)調(diào)控陽(yáng)離子表面活性劑體系和DNA/表面活性劑比例，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法和商品化轉(zhuǎn)染試劑Lipof