巴斯德畢赤酵母表達人組織激肽釋放酶（hKLK1）的研究.pdf

1、人組織激肽釋放酶(hKLK1)是一組緊密相關(guān)的絲氨酸蛋白酶亞家族中的一員，能夠特異性的剪切肽前體，釋放有生物學(xué)活性的肽分子。hKLK1的一個最顯著的功能是能將其底物激肽原切割而釋放出一種有效的血管舒張物質(zhì)激肽，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)局部血液循環(huán)以及腎臟的水和電解質(zhì)平衡等功能。近來的研究顯示，激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)與人和動物的高血壓有關(guān)。 最近用甲醇營養(yǎng)型酵母PichiaPastoris作為重組蛋白表達系統(tǒng)正變得越來越普及。P.Pastori

2、s比哺乳動物細胞更容易進行基因操作及培養(yǎng)，并能生長至很高的細胞密度。同樣重要的是，P.Pastoris是一種真核生物，因此具有蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能，使得重組蛋白以可溶型方式表達和正確的方式進行折疊。另外，線性化的質(zhì)粒DNA能通過同源重組的方式高效率插入酵母基因組，產(chǎn)生穩(wěn)定的多拷貝整合表達載體的細胞系，加之表達載體中的強啟動子，可驅(qū)動外源目的基因的高效表達。 本研究通過將人組織激肽釋放酶(hKLK1)原編碼序列克隆入PichiaP

3、astoris分泌型表達載體pPIC9K中，獲得pPIC9K-KLK1表達載體。分別用SalⅠ及BglⅡ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化GS115酵母菌株，經(jīng)MD平板后在含不同抗性濃度的G418YPD平板上培養(yǎng)，篩選獲得抗3mg/mlG418Mut+型分泌表達hKLK1的重組酵母菌3株，抗1mg/mlG418Muts型分泌表達hKLK1的酵母菌2株。通過Western-blotting證明，表達的重組hKLK1分子量正確，酶活性約為4.2U/ml。在