辣椒內(nèi)參基因的篩選及NBS-LRR類抗病基因同源序列的鑒定.pdf

1、辣椒（Capsicum annuum L.）是世界范圍內(nèi)重要的蔬菜作物之一，在生產(chǎn)上，辣椒容易感染由細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等多種病原菌體引起的各類病害，這些病害嚴(yán)重制約著辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，尋找抗病基因來培育抗病品種，對(duì)防治辣椒病害具有重要意義。本研究利用同源序列克隆法分離得到了辣椒NBS-LRR類抗病基因的同源序列（CaRGAs），并對(duì)這些CaRGAs進(jìn)行了聚類和表達(dá)分析;另外本實(shí)驗(yàn)還對(duì)辣椒內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，篩選出了適合

2、做實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的辣椒內(nèi)參基因。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.辣椒內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)
　　 以甜辣椒自交系“PBC631B”為實(shí)驗(yàn)材料，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三種生物學(xué)軟件對(duì)辣椒7個(gè)內(nèi)參基因(ACT、UBI-1、UBI-3、GAPDH、EIF5A2、β-TUB和α-TUB)在不同的組織器官、非生物脅迫和激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。不同組織器官包括

3、辣椒根、莖、葉、花蕾、果實(shí)和種子;不同非生物脅迫包括高溫脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫和鹽脅迫;不同激素處理包括水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)處理。
　　 結(jié)果表明，β-TUB和UBI-3兩種內(nèi)參基因在非生物脅迫和激素處理的條件下表達(dá)穩(wěn)定性較強(qiáng)，然而在不同的組織器官及總的樣品中UBI-3和GAPDH的表達(dá)是最穩(wěn)定的。相反地，在所選擇的整個(gè)樣品中，UBI-1和ACT內(nèi)參基因的表達(dá)是最不穩(wěn)定的，不適合用作辣椒的內(nèi)參基因。
　　

4、2.辣椒NBS-LRR類型抗病基因同源序列的克隆及表達(dá)分析
　　 為了研究辣椒NBS-LRR類抗病基因的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，本文運(yùn)用前人根據(jù)NBS-LRR抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的簡并引物，以辣椒“PBC631B”的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離得到辣椒NBS-LRR類CaRGAs，并對(duì)這些CaRGAs進(jìn)行了聚類比對(duì)分析，另外運(yùn)用RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)分析了4個(gè)CaRGAs在辣椒根、莖、葉及其在激素處理（SA和ABA

5、）條件下的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果表明，利用同源序列克隆法共獲得了17個(gè)具有完整開放閱讀框的辣椒抗病基因同源序列(RGAs)，命名為CaRGA01-CaRGA17。多重序列比對(duì)顯示這些序列都含有NBS-LRR類基因的六個(gè)結(jié)構(gòu)域:P-loop，RNBS-A-nonTIR或RNBS-A-TIR，Kinase-2，RNBS-B，RNBS-C和GLPL，說明擴(kuò)增的序列屬于NBS-LRR類基因家族。通過與已知六個(gè)抗病基因(RPM1，Gpa2

6、，L6, M,N和Prf)的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)這17個(gè)序列被分為TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR兩組，進(jìn)一步劃分為四個(gè)亞組（CaRGAⅠ～CaRGAⅣ）。其中，CaRGA01和CaRGA13分別與來自番茄（Solanum lycopersicum）抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病基因Bs4和番茄（Solanum sp.VFNT）抗線蟲基因Mi-1.4相似性最高（分別為90％和91％），推測他們可能是相關(guān)抗病基因的一部分。RT