水稻抗病基因同源序列分析及抗稻瘟病候選基因克隆.pdf

1、稻瘟病菌（有性態(tài)：Magnaporthe grisea，無性態(tài)：Pyricularia grisea）引起的稻瘟病是我國稻區(qū)和世界其它稻區(qū)最為嚴(yán)重的病害之一，該病害常年流行，致使稻米生產(chǎn)損失嚴(yán)重。稻瘟病的發(fā)生和流行同樣要求流行病學(xué)三要素，即病原體、寄主、環(huán)境。選育和利用抗病品種不僅是有效切斷流行病學(xué)三要素之一，為防止植物病害最經(jīng)濟、最有效的途徑，而且還可以避免或減輕因使用農(nóng)藥而造成的殘毒和環(huán)境污染問題。因此，抗病性一直為植物育種目標(biāo)之一

2、。抗病育種原理深入研究，對植物抗病育種具有理論指導(dǎo)和促進育種的作用。本研究通過分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法，對四川省育種遺傳材料和日本晴基因組進行了較為系統(tǒng)地研究：并結(jié)合育種實踐提出了獨特的抗病雜交育種方法。概括如下： 1．利用模糊搜索的方法，在TIGR水稻日本晴基因組數(shù)據(jù)庫（TIGR Rice Genome Annotation-Release5）中識別出565個編碼抗病蛋白質(zhì)的同源序列；利用識別出565個編碼抗病蛋白質(zhì)序列分

3、別與秈稻基因組數(shù)據(jù)庫進行BLASTP聯(lián)配，共確定320個對應(yīng)的抗病基因同源序列。通過在線生物信息學(xué)軟件，我們識別了這565個抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域、保守模體和DNA序列內(nèi)轉(zhuǎn)座子元件，其中有14個抗病基因同源序列注釋錯誤。同時繪出了這些基因的基因組分布，并基于這些基因的同源樹分析和基因組物理分布，認(rèn)為基因的原位和遠(yuǎn)程復(fù)制事件產(chǎn)生了抗病基因的現(xiàn)存分布和多樣性，其中轉(zhuǎn)座子在復(fù)制過程中扮演了重要角色。 2．利用25個稻瘟病鑒別品種（系）和

4、20個水稻品種（系）在人工接種條件下的對稻瘟病單孢菌株的抗性表型和抗病基因同源序列（Resistance gene analogs，RGAs）多態(tài)性進行聚類比較分析。以單孢菌株接種的抗性表型聚類，取相似系數(shù)0．450，可將45個品種（系）劃分為A、B兩大類；取相似系數(shù)0．618，A、B兩大類又分別可分為i、ii、111、iv四個亞類。以抗病基因同源序列多態(tài)性聚類，取遺傳相似系數(shù)0．620，可將45個品種（系）劃歸Ⅰ，Ⅱ兩類，這兩類明顯地

5、趨向秈粳兩亞種劃分；取遺傳相似系數(shù)0．783時，類群Ⅰ又可劃分為i、ii、iii、iv、v、vi六個亞類，類群Ⅱ又可劃分為i、ii、iii、iv、v、vi、vii七個亞類。用抗感單孢稻瘟病菌表型聚類，傾向于抗譜相似的聚為一類；按RGA相似性聚類，傾向于遺傳背景相近的聚為一類。對于抗病頻率低或是抗病頻率高的品種兩者類與類之間有較好的對應(yīng)關(guān)系，但總體看來類與類之間沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系。在抗稻瘟病育種方面，對親本材料進行單孢菌株抗性鑒定和抗病基

6、因同源序列多態(tài)性分析，可以更準(zhǔn)確地反映親本抗性遺傳背景，從而避免同一抗源反復(fù)使用，還可以豐富培育品種的抗性遺傳基礎(chǔ)和延長品種抗性。 3．以高抗稻瘟病的水稻保持系福伊B為材料，利用已知在水稻秈、粳亞種間存在差異的RGA簡并性引物N1N2克隆RGA序列片段。通過對抗病品系福伊B克隆擴增，獲得一個通讀的水稻抗病基因NBS類抗病基因同源片段FUyi_NBS1，長度為540bp，編碼176個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)Uyi_NBS1在

7、水稻基因組第二染色體上有3個拷貝，其中兩個為抗病基因拷貝；經(jīng)Blastp比較，含有一個NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域，與OsI_005459和CR273高度同源；與大麥NBS-LRR類抗病基因同源序列CAD45026同源率為58％。同源建模分析發(fā)現(xiàn)FUyi_NBS1包含至少7個α-螺旋區(qū)域和3個β-折疊。 4．利用GenBank數(shù)據(jù)庫中的候選基因序列，設(shè)計分子引物，進行抗感品種之間的擴增差異，進行亞克隆抗病基因同源序列。在抗稻瘟病品系福

8、伊B中獲得了2條抗病基因同源序列，分別記為“FY_2”和“FY_3”，長度大小分別為2518bp和4168bp。經(jīng)過生物信息學(xué)分析， FY_2的mRNA長度為1902bp，編碼634個氨基酸；FY_3的mRNA長度為2226bp，編碼742個氨基酸。通過蛋白質(zhì)序列分析，兩者均屬于CC-NBS類型的抗病基因同源序列。與秈稻第2號染色體上的鳥槍片斷OsI_005457高度同源。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)FY_2的NBS結(jié)構(gòu)域與OsI_0054