馬鈴薯抗病同源序列系統(tǒng)進化分析及晚疫病抗病基因的克隆.pdf

1、馬鈴薯是僅次于水稻、小麥、玉米的世界第四大糧食作物，在國民經(jīng)濟中具有重要作用。馬鈴薯晚疫病是威脅馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害之一，傳統(tǒng)防治馬鈴薯晚疫病方法主要是采用抗菌劑及抗性育種策略。植物基因工程技術(shù)的不斷完善和應(yīng)用為馬鈴薯晚疫病的防治研究提供了新的契機，從馬鈴薯抗病資源中挖掘具有較高抗性的抗病基因，并將其導(dǎo)入到栽培品種中，無疑是我們獲得和培育抗晚疫病馬鈴薯品系較為快捷的手段。本研究采用抗病基因同源序列法(即RGA法)，結(jié)合RACE技術(shù)克隆馬

2、鈴薯晚疫病抗病基因，研究結(jié)果如下： (1)馬鈴薯抗病基因同源序列(RGAs)的分離和相似性分析以馬鈴薯抗晚疫病野生品種Solanumdimissum為試材，根據(jù)GenBank中已登錄的植物抗病基因(R3a、R1、Rpi-blb1、Rpi-blb2，I2，I2C-1等)的NBS區(qū)的保守序列P-loop和GLPL區(qū)設(shè)計簡并引物，以S.demissum的cDNA作模板進行RT-PCR擴增，共獲得30條具有開放閱讀框的含NBS區(qū)保守結(jié)構(gòu)

3、域的序列，利用生物信息學(xué)軟件對所得序列進行同源性比較和系統(tǒng)進化分析，30條具開放閱讀框的序列根據(jù)核酸相似性90％為界共分成9類，皆為馬鈴薯的抗病基因同源序列(RGAs)，且全部屬于nonTIR-NBS-LRR類型。 (2)馬鈴薯晚疫病抗病基因候選基因的確定根據(jù)9類RGAs聚類分析結(jié)果分別設(shè)計特異引物，對S.demissum及六個對照栽培品種進行PCR和RT-PCR檢測，結(jié)果表明：第Ⅳ(PB6-22)類僅在S.demissum中存

4、在，第Ⅵ類(PB1-1)在S.demissum和大西洋中呈陽性，而其他類RGAs在所有的七個品種中都有擴增產(chǎn)物。初步確定第Ⅳ類和第Ⅵ類為馬鈴薯抗晚疫病相關(guān)的候選基因。 (3)晚疫病抗病基因的克隆利用RACE技術(shù)克隆出了第Ⅳ類(PB6-22)的基因，該基因命名為Sdpa，基因全長為3570bp，編碼1189氨基酸，該基因含有抗病基因的NBS保守結(jié)構(gòu)域(P-loop、Kinase2、Kinase-3a、GLPL等)，并在此基因中鑒定