綠豆NBS-LRR類抗病基因克隆及其表達研究.pdf

1、綠豆是重要的農(nóng)作物之一，綠豆中的某些成分有直接抑菌作用，抗病性極強。大豆不僅是人們的食用糧食，而且是飼料的重要來源，但是每年大豆產(chǎn)量因病害而大量減少，若是能從綠豆中克隆出抗病基因，再轉(zhuǎn)化大豆等農(nóng)作物，增強大豆等經(jīng)濟作物的抗病性，將減少農(nóng)藥使用帶來的環(huán)境污染等副作用。通過植物抗病基因的克隆并且轉(zhuǎn)化大豆等農(nóng)作物的研究，對于抗病育種和抗病機理的理解具有重要意義。
　　目前，已有不少植物抗病基因及抗病基因同源序列被分離出來，這些抗病基因都

2、各具特點，大多數(shù)具有NBS結(jié)構(gòu)域，但是還沒有綠豆NBS抗病基因被克隆出來，雖然目前從各種植物中克隆了很多NBS類抗病基因及抗病基因同源序列，但基本沒有將其轉(zhuǎn)化，并對其具體功能進行驗證。
　　本研究通過克隆綠豆NBS-LRR類抗病基因同源序列，將其轉(zhuǎn)化煙草及大豆，初步研究了序列在煙草及大豆中的轉(zhuǎn)化情況，并對轉(zhuǎn)基因植株的抗病性做了初步檢測。本論文主要方法和結(jié)果如下：
　　1、根據(jù)已克隆植物NBS-LRR抗病類基因（RGAs）保守

3、序列設(shè)計引物，從野生綠豆基因組DNA中分離得到了3條同源序列片段FGV-1，F(xiàn)JV-2，F(xiàn)JV-3（GenBank登錄號分別為KF021265、KF661550、KF661551）。經(jīng)BLAST分析表明，F(xiàn)GV-1，F(xiàn)JV-2，F(xiàn)JV-3與已報道的大豆、蕓豆、鷹嘴豆等植物的RGAs有較高的同源性。經(jīng)過Blastp分析表明，F(xiàn)GV-1、FJV-2、FJV-3基因翻譯的氨基酸序列中含有植物抗病保守結(jié)構(gòu)域NB-ARC，具有抗病基因NBS特征結(jié)

4、構(gòu)域：p-loop環(huán)、激酶2α、激酶3α及HD，推測序列FGV-1、FJV-2、FJV-3可能是綠豆NBS類抗性基因的核心區(qū)域。系統(tǒng)進化分析表明，3條綠豆RGA序列可分為兩個不同的類群：TIR-NBS和non-TIR-NBS。
　　2、利用pFGC5941構(gòu)建植物表達載體pFGC5941-FGV-1，通過酶切驗證、PCR檢測及測序表明載體構(gòu)建成功。
　　3、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將序列轉(zhuǎn)化煙草及大豆，PCR鑒定結(jié)果顯示，獲得pFG

5、C5941-FGV-1轉(zhuǎn)基因大豆植株27株，煙草20株，獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株后代種子24顆，經(jīng)抗除草劑檢測結(jié)果表明，序列已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入大豆及煙草。
　　4、提取轉(zhuǎn)基因大豆葉片RNA，利用RT-PCR檢測結(jié)果表明，外源FGV-1基因已經(jīng)在大豆葉片中表達。
　　5、用煙草花葉病毒侵染轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因煙草葉片，幾天后，非轉(zhuǎn)基因煙草葉片表現(xiàn)出花葉病病癥，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片無明顯變化。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草葉片表現(xiàn)出一定的抗病性。