雞CD4基因片段的原核表達(dá)與單克隆抗體制備.pdf

1、CD4分子是T 淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T 淋巴細(xì)胞重要的表面標(biāo)志。雞CD4基因定位于1 號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)11.5kb，共有10個(gè)外顯子。雞CD4基因編碼的成熟蛋白包含由四個(gè)類免疫球蛋白的胞外區(qū)（402個(gè)氨基酸），一個(gè)疏水跨膜區(qū)（24個(gè)氨基酸）和一個(gè)較長(zhǎng)的胞漿區(qū)（33個(gè)氨基酸）組成。
　　 CD4分子主要存在于輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面。CD4分子作為輔助受體參與TCR 對(duì)MHCⅡ

2、類分子遞呈抗原的識(shí)別。
　　 CD4 還是一類信號(hào)傳遞受體，分子胞內(nèi)部分通過酪氨酸激酶途徑參與經(jīng)TCR 介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)一系列的免疫應(yīng)答。雞和哺乳動(dòng)物的CD4分子在結(jié)構(gòu)和功能上的保守性很高，這些保守性與雞的免疫系統(tǒng)緊密相關(guān)。為建立雞CD4分子的檢測(cè)方法，進(jìn)一步研究其基因結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)作用，本研究進(jìn)行了雞CD4分子基因片段的原核表達(dá)、單克隆抗體制備和單抗的免疫學(xué)活性鑒定。
　　 首先，參照GenBank中已經(jīng)登錄的

3、雞CD4 cDNA序列，以及pET-32a 載體多克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了雞CD4分子中去除信號(hào)肽的N 端2個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)基因片段。其大小為579bp，與GenBank中登錄的雞CD4(登錄號(hào)：Y12012)的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全一致。將其插入表達(dá)載體pET-32a，獲得了重組表達(dá)載體pET-32a-CD4。將此重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，優(yōu)化表達(dá)條件后進(jìn)行誘導(dǎo)以大量表達(dá)目的蛋白。裂解誘導(dǎo)培養(yǎng)

4、的菌體純化包涵體，包涵體再經(jīng)過體外溶解、復(fù)性后經(jīng)Ni-NTA 純化介質(zhì)純化得到了His-CD4 融合蛋白，符合預(yù)測(cè)結(jié)果，大小約為42KD。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His-NTA 樹脂親和層析柱分離純化，得到了純度較好的雞His-CD4 融合蛋白。
　　 其次，將純化后的His-CD4 融合蛋白免疫8周齡的Balb/c 小鼠。經(jīng)4 次免疫，血清抗體達(dá)到1：10000以上，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。經(jīng)多次亞克隆和細(xì)胞上清液中抗體檢測(cè)

5、，獲得一株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E12。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該細(xì)胞株上清液的抗體與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。將該細(xì)胞株注射Balb/c 小鼠腹腔，制備腹水，腹水抗體的間接ELISA 效價(jià)為1:105。用試劑盒鑒定的單抗的免疫球蛋白亞類為IgG2b。
　　 綜上所述，本研究在成功克隆雞CD4基因片段的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá)重組載體pET-32a-CD4 質(zhì)粒，并表達(dá)獲得了目的基因的融合蛋白。通過細(xì)胞融合制備了穩(wěn)定分