土撥鼠CD4分子的克隆和抗體制備.pdf

1、目的：
　　 1.克隆土撥鼠和旱獺CD4分子。制備多克隆，單克隆抗體，并對其特性進(jìn)行初步鑒定。
　　 2.建立小鼠和旱獺的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測方法，為wCD4抗體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 方法：
　　 1．從土撥鼠PBMC中克隆CD4的cDNA序列，測序并比對分析wCD4和其它哺乳動(dòng)物CD4的核苷酸、氨基酸同源性。
　　 2.從中國旱獺PBMC中克隆CD4的cDNA序列，測序并比對分析wCD4和c

2、wCD4序列同源性。
　　 3.從旱獺肝組織或新鮮分離的PBMC中，用蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法獲得DNA。PCR擴(kuò)增旱獺細(xì)胞色素b基因進(jìn)行種系發(fā)生分析。
　　 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測感染W(wǎng)HV的旱獺肝內(nèi)CD4的表達(dá)水平的變化。為以后的CD4抗體體內(nèi)試驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　 5. 原核誘導(dǎo)表達(dá)純化wCD4蛋白，免疫兔子制備wCD4的多克隆抗體，鑒定抗體的效價(jià)和特異性。
　　 6. 原核表達(dá)純化的

3、wCD4蛋白以Al(OH)3佐劑化，常規(guī)免疫Balb/c小鼠。通過細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和免疫后的小鼠脾細(xì)胞融合，用免疫原蛋白包被板子經(jīng)ELISA方法進(jìn)行初篩。經(jīng)真核表達(dá)質(zhì)粒CD4轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后做免疫熒光復(fù)篩。得到的陽性克隆，通過三次有限稀釋法，篩選出穩(wěn)定分泌anti-wCD4的雜交瘤細(xì)胞。收集雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，采用ELISA方法測定單克隆抗體Ig亞類。用雜交瘤細(xì)胞制備小鼠腹水。測定腹水和培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià)。

4、將小鼠腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨純化。
　　 7. 采用ELISA，Western blot，IF對wCD4單克隆抗體進(jìn)行特異性的鑒定。
　　 8. 用wCD4采用Western blot，IF， IHC的方法檢測旱獺PBMC和肝內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞。
　　 9. 采用MTT法和CFSE法檢測小鼠脾細(xì)胞和旱獺PBMC細(xì)胞的增
　　 結(jié)果：
　　 1.獲得土撥鼠CD4分子全長序列共1359bp，核苷酸序列與

5、人、猩猩、兔、貓、豬、狗、小鼠、大鼠、鴨、雞的同源性分別為76.00％、75.33％、73.13％、72.39％、71.29％、71.15％、69.09％、69.31％、53.89％、52.79％。
　　 2.獲得旱獺CD4胞外段序列，和土撥鼠CD4分子比對，核苷酸同源性99.6％。
　　 3.通過種系發(fā)生分析，發(fā)現(xiàn)旱獺和土撥鼠高度同源。
　　 4.RT-PCR法檢測旱獺WHV感染后，肝內(nèi)CD4 mRNA在感染后

6、第二周有表達(dá)高峰。提示W(wǎng)HV感染后，CD4在早期就開始活化。為以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了CD4阻斷的時(shí)間點(diǎn)。
　　 5. 成功構(gòu)建土撥鼠CD4的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，經(jīng)過大量誘導(dǎo)表達(dá)純化獲得目的蛋白。用純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得高效價(jià)的特異性多克隆抗體，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），Western blot，免疫熒光檢測，抗體的靈敏度和特異性均較高.為以后的單克隆抗體制備提供了篩選依據(jù)。
　　 6．獲

7、得四株可穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的細(xì)胞,命名為G1；G2；C9；C10。所分泌單克隆抗體均屬IgG1亞類。經(jīng)持續(xù)6個(gè)月培養(yǎng)，低血清適應(yīng)以及反復(fù)凍存與復(fù)蘇后，仍能保持其穩(wěn)定的細(xì)胞增殖和抗體分泌能力。細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)為103～104，腹水中抗體效價(jià)為107～108。
　　 7. 采用Western blot，IF的方法，該四株單克隆抗體均能識(shí)別真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1-wCD4轉(zhuǎn)染BHK后表達(dá)的wCD4分子。因?yàn)樵撍闹昕贵w

8、都可以用于WBIF的檢測，所以推斷該四株抗體識(shí)別的應(yīng)為CD4分子天然構(gòu)象中的線性表位。
　　 8. 采用IF，IHC的方法，該四株抗體均能識(shí)別旱獺PBMC中的CD4+T細(xì)胞。
　　 9. 采用IHC的方法，發(fā)現(xiàn)旱獺WHV感染后，第五周肝內(nèi)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞浸潤明顯增加。
　　 10.成功建立小鼠和旱獺流式檢測細(xì)胞增值試驗(yàn)的方法。為以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功克隆出土撥鼠

9、CD4全長和旱獺CD4部分序列，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)他們的同源性99.6％。旱獺種系發(fā)生分析結(jié)果顯示中國旱獺和土撥鼠高度同源。為進(jìn)一步在土撥鼠、旱獺動(dòng)物模型中研究WHV和免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.成功制備了特異性的高效價(jià)抗woodchuck CD4多克隆抗體。該多克隆抗體可以檢測到真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1-wCD4轉(zhuǎn)染BHK后細(xì)胞表面表達(dá)的wCD4.為下一步的單抗篩選奠定基礎(chǔ)。
　　 3.成功制備了四株能分泌