巨型艾美球蟲(chóng)免疫原性相異株間消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及其差異表達(dá)基因分析.pdf

1、雞球蟲(chóng)病(Coccidiosis)是由數(shù)種艾美球蟲(chóng)(Eimeria)寄生在雞腸道黏膜細(xì)胞內(nèi)引起的一種寄生性原蟲(chóng)病。在雞的各類疾病中，球蟲(chóng)病發(fā)病率最高，是養(yǎng)禽業(yè)危害最嚴(yán)重的禽病之一。目前，雞球蟲(chóng)病的防治仍然以藥物預(yù)防為主，但隨著耐藥蟲(chóng)株的廣泛出現(xiàn)，藥物預(yù)防的效果越來(lái)越差，而且藥物的長(zhǎng)期使用會(huì)殘留肉蛋，污染環(huán)境，影響人體健康，故球蟲(chóng)病的防治趨勢(shì)由藥物轉(zhuǎn)向了免疫預(yù)防。巨型艾美球蟲(chóng)(Eimeria.maxima)是在田間最常見(jiàn)的3種球蟲(chóng)之一，具

2、有最強(qiáng)的免疫原性和一定的交叉免疫保護(hù)力，故在球蟲(chóng)疫苗中，E.maxima是不可缺少的蟲(chóng)種之一，但E.maxima在不同株間抗原變異最顯著，有時(shí)可因疫苗株與田間株間的抗原差異而導(dǎo)致免疫效果不佳，甚至失敗。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，巨型艾美球蟲(chóng)上海株(SH strain)和南通株(NT strain)在免疫原性方面存在著顯著的差異，即上海株僅對(duì)同源株攻擊產(chǎn)生免疫保護(hù)力，而南通株對(duì)同源株與異源株攻擊均能產(chǎn)生免疫保護(hù)力。為了探索這兩株球蟲(chóng)在免疫原性

3、上差異的分子基礎(chǔ)，本文開(kāi)展了下列研究工作。
　　 1 E.maxima SH株和NT株未孢子化卵囊階段消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　 用常規(guī)方法分別從E.maxhna SH株和NT株未孢子化卵囊中提取總RNA，并用纖維素柱純化得到mRNA。在分別用球蟲(chóng)的mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別以SH株cDNA為試驗(yàn)組(tester)，NT株cDNA為驅(qū)動(dòng)組(driver)，或相反以NT株cDNA為tester，SH株c

4、DNA為驅(qū)動(dòng)組driver，經(jīng)過(guò)兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR后，將PCR產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，分別構(gòu)建了2個(gè)抑制性消減文庫(kù)。隨機(jī)從兩個(gè)消減文庫(kù)中挑取陽(yáng)性克隆，用接頭引物nest primer1和nest primer2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)PCR鑒定顯示E.maxima SH株和E.maxima NT株未孢子化卵囊消減cDNA文庫(kù)的重組率分別為95％(284/300)和8

5、9％(231/261)，差異基因片段大小分布在0.25 kb～1.0 kb之間。
　　 2 E.maxima SH株和NT株未孢子化卵囊階段消減cDNA文庫(kù)中差異表達(dá)基因的篩選與分析
　　 首先，用地高辛標(biāo)記方法制備了4種探針，即SH株消減組cDNA探針、SH株未消減組cDNA探針和NT株消減組cDNA探針、NT株未消減組cDNA探針。隨后，分別用同源株消減組探針和異源株未消減組探針對(duì)同一克隆進(jìn)行檢測(cè)，篩選差異表達(dá)克隆。

6、在被檢測(cè)的515個(gè)克隆(SH株284個(gè)，NT株231個(gè))中，共獲得86個(gè)差異表達(dá)克隆，其中SH株63個(gè)，NT株23個(gè)。對(duì)差異表達(dá)克隆測(cè)序和同源性比對(duì)，共獲得10個(gè)重疊群(Contigs)，其中SH株6個(gè)，NT株4個(gè)。通過(guò)BLAST分析，SH株的6個(gè)contigs中5個(gè)見(jiàn)有同源序列，1個(gè)未見(jiàn)同源序列，可能為新基因；NT株的4個(gè)contigs中3個(gè)見(jiàn)有同源序列，1個(gè)未見(jiàn)同源序列，可能為新基因。最后，選取6個(gè)差異表達(dá)基因，根據(jù)其序列分別設(shè)計(jì)引