毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫的構(gòu)建與篩選.pdf

1、毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）是雞球蟲病的重要病原之一，主要危害8～18周齡的雞，引起雞的急性小腸球蟲病。近年來，隨著黃羽雞在我國的飼養(yǎng)量不斷攀升，由毒害艾美耳球蟲引起的急性小腸球蟲病越來越多見，給養(yǎng)雞業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。子孢子是球蟲入侵腸道細胞的首要階段，也是防治球蟲病的首要靶點。為此，本文以毒害艾美耳球蟲子孢子為材料，構(gòu)建毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫，通過免疫學(xué)篩選和質(zhì)粒文庫篩選獲取毒害艾美耳球蟲候選抗原或

2、功能基因，旨為研究毒害艾美耳球蟲基因工程疫苗和入侵宿主機制等奠定基礎(chǔ)。
　　首先，分離純化毒害艾美耳球蟲子孢子和制備多克隆抗體。25日齡健康雛雞每羽經(jīng)嗉囊接種2×104個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊，接種后第7～12天按常規(guī)方法從糞便中分離卵囊，培養(yǎng)至孢子化;孢子化卵囊經(jīng)20％次氯酸鈉溶液處理20 min后，用1.1 M蔗糖溶液漂浮，純化卵囊;卵囊用玻璃珠破壁后，經(jīng)10μm的濾膜過濾，收集濾液，離心純化孢子囊;孢子囊經(jīng)0.75％胰酶消

3、化釋放出子孢子，用DEAE-52纖維素柱分離純化子孢子;用反復(fù)凍融和冰浴超聲裂解法提取子孢子蛋白，按每鼠100μg蛋白量免疫8周齡BALB/c小鼠3次，制備鼠多抗血清;以制備的鼠多抗為一抗，HRP標記的兔抗鼠IgG為二抗，TMB為顯色劑，建立檢測抗子孢子抗原多抗的間接ELISA法。結(jié)果顯示，獲得的子孢子純度高、活性好，子孢子回收率約40％;抗原的最適包被濃度是1μg/mL，鼠多抗最適稀釋倍數(shù)為1∶200，HRP標記的兔抗鼠IgG稀釋倍數(shù)

4、為1∶2000;制備的鼠多抗效價高。
　　其次，構(gòu)建毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫。用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲子孢子總RNA，經(jīng)完整性檢測和純度分析后反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，接著經(jīng)LD-PCR擴增獲得雙鏈cDNA;雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化、，SfiⅠ酶切后，用CHROMA SPIN-400柱分離純化cDNA片段;cDNA片段經(jīng)T4 DNA連接酶與λTripIE×2載體連接，連接產(chǎn)物用λ噬菌體包裝蛋白包裝，獲得初始文

5、庫;以在XL1-Blue大腸桿菌平板上形成的噬斑數(shù)以及藍色噬菌斑與無色噬菌斑數(shù)的比例，測定cDNA未擴增文庫與擴增文庫的滴度和重組率;最后用PCR方法測定插入片段的長度。結(jié)果顯示，總RNA的OD260/OD280值為1.9，樣品的28 S和18S條帶清晰，原始文庫容量為3.1×106 pfu/mL，重組率為96.3％，擴增后的文庫容量為1.1×1010 pfu/mL，插入片段長度300～1500 bp。
　　最后，用2種途徑篩選毒

6、害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫，獲得EST序列。(1)免疫篩選，用制備的鼠多抗為探針，對文庫進行篩選，初次篩選共篩出疑似陽性克隆35個，復(fù)篩后確定陽性克隆19個;將復(fù)篩得到的陽性噬菌體載體λTriplEx2轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒載體pTriplEx2后，進行序列測定和比對分析，共得到8個重疊群，序列長度分別為1027、820、900、1176、645、987、719、858 bp。(2)質(zhì)粒文庫選出，直接將λTriplEx2噬菌體文庫轉(zhuǎn)化為pTri