雞球蟲3-1E基因重組蛋白的免疫原性及免疫保護(hù)效果研究.pdf

1、雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)的最重要寄生蟲病之一,分布廣,感染率高,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前,藥物防治是控制球蟲病的主要手段,但是隨著耐藥蟲株的普遍產(chǎn)生及綠色食品概念的形成,人們期望用更好的手段取代之。隨著分子生物化學(xué)、免疫學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展,依靠生物技術(shù)來(lái)研制基因工程疫苗或核酸疫苗已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。本課題對(duì)E tenella3-1E基因進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)對(duì)E tenella ZJ株的3

2、-1E基因進(jìn)行了克隆和序列分析。根據(jù)已報(bào)道的堆型艾美爾球蟲3-1E基因序列設(shè)計(jì)引物,以E tenella ZJ株孢子化卵囊子孢子中提取的總RNA為模板用RT-PCR方法擴(kuò)增得到雞球蟲子孢子表面抗原3-1E基因。將PCR產(chǎn)物克隆至pUCm-T轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),經(jīng)酶切和PCR鑒定獲得陽(yáng)性重組菌,并進(jìn)行測(cè)序。序列分析表明:E tenella ZJ株3-1E基因的ORF為513個(gè)堿基,共編碼171個(gè)氨基酸,與國(guó)外報(bào)道的雞球蟲3-1E基因序列進(jìn)

3、行比較,發(fā)現(xiàn)有3處發(fā)生堿基突變,其核苷酸序列同源性為99.5％;有兩個(gè)氨基酸發(fā)生突變,氨基酸序列同源性為98.2％。
　　 將重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-30a分別以EcoRⅠ、.SalⅠ酶切后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-30a-3-1E,并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中,提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)顯示,3-1E基因在大腸桿菌中成功表達(dá),融合蛋白的分子量

4、約為27kDa,誘導(dǎo)6h的蛋白表達(dá)量可達(dá)到47.02％。
　　 以經(jīng)鎳柱純化的重組融合蛋白作為免疫原,添加人參納米顆粒作為佐劑,比較了3-1E重組融合蛋白(100μg胸肌注射)、低劑量3-1E重組融合蛋白(10μg)+人參納米顆粒、中劑量3-1E重組融合蛋白(50μg)+人參納米顆粒、高劑量3-1E重組融合蛋白(100μg)+人參納米顆粒的免疫原性,另設(shè)空白對(duì)照組。在3日齡時(shí)進(jìn)行首免,首免后兩周后以相同劑量進(jìn)行二免,二免后一周開

5、始每組心臟采血,進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)和胸腺細(xì)胞檢測(cè)法檢測(cè)IL-1活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各免疫組特異性抗體于二免后三周達(dá)到較高水平,隨后開始下降,但直至二免后六周仍維持在一定水平;淋巴細(xì)胞增殖水平和IL-1誘生活性均在二免后四周達(dá)到高峰。結(jié)果表明:3-1E融合蛋白免疫后能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖水平、血清抗體水平和IL-1誘生活性,人參納米顆粒能顯著提高3-1E融合蛋白的免疫應(yīng)答水平。
　　 探討了3-1E重組融合蛋白(1

6、00μg胸肌注射)、低劑量3-1E重組融合蛋白(10μg)+人參納米顆粒、中劑量3-1E重組融合蛋白(50μg)+人參納米顆粒、高劑量3-1E重組融合蛋白(100μg)+人參納米顆粒的免疫保護(hù)效果。設(shè)上述4個(gè)實(shí)驗(yàn)組,外加空白對(duì)照組、感染對(duì)照組、藥物對(duì)照組。免疫程序同上,二免后兩周按1.5×104個(gè)/羽的劑量,用新鮮擴(kuò)繁的孢子化卵囊攻毒,觀察其免疫效力。結(jié)果表明:高劑量3-1E重組融合蛋白+人參納米顆粒免疫組雞只的增重率、相對(duì)增重率、卵囊