巨型艾美耳球蟲Emgam56基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、雞球蟲病是由多種艾美耳球蟲（Eimeria）寄生于雞腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一種寄生原蟲病，不僅引起雞發(fā)病死亡，還可嚴(yán)重影響雞的生長發(fā)育，降低飼料報酬。目前雞球蟲病的防治主要依靠化學(xué)藥物，其次是雞球蟲病活疫苗。隨著抗球蟲藥物的廣泛與大量使用，球蟲耐藥性以及人們對藥物殘留肉蛋、污染環(huán)境等諸多問題也隨之出現(xiàn)。同時活球蟲疫苗又存在生產(chǎn)成本高、容易擴(kuò)散病原、容易引起腸炎發(fā)生等弊端。為此，亞單位疫苗已成為雞球蟲病疫苗的發(fā)展方向。CoxAbic(

2、R)是由巨型艾美耳球蟲（E.maxima）配子體蛋白EmGam56、EmGam82和EmGam230組成的一種亞單位疫苗，在其生產(chǎn)過程中需從感染雞體分離純化配子體，然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白，因此生產(chǎn)費(fèi)時、成本昂貴。利用基因重組技術(shù)研制基因工程疫苗可能解決這一難題。
　　巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，不僅具有操作簡單、生長速度快、發(fā)酵成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，還具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白翻譯后的加工修飾功能，該系

3、統(tǒng)所表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性和生物學(xué)功能與天然蛋白質(zhì)更為接近。因此，本研究在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)了E.maxima配子體蛋白Emgam56基因，檢測了酵母表達(dá)蛋白rEmGam56的抗原特異性和免疫原性，并通過動物免疫保護(hù)試驗(yàn)比較分析了酵母表達(dá)蛋白rEmGam56和原核表達(dá)蛋白rEmGam56對E.maxima的免疫保護(hù)效果，為重組配子體抗原亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　1.巨型艾美耳球蟲Emgam56基因的畢赤酵母表達(dá)及其初步鑒定<

4、br>　　根據(jù)Emgam56基因去除信號肽后的ORF序列和真核表達(dá)載體pPICzαA的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對特異性引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGEM-T-Emgam56為模板，PCR擴(kuò)增出目的片段，插入表達(dá)載體pPICzαA中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICzαA-Emgam56。對酶切鑒定和PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將連接正確的重組質(zhì)粒線性化后用電穿孔法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，利用博萊霉素(Zeocin)抗性篩選多拷貝重組菌株，搖

5、瓶水平進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所得蛋白大小約為11.6kDa，且能被6×HIS單抗識別。
　　2.巨型艾美耳球蟲畢赤酵母重組表達(dá)蛋白rEmGam56的免疫原性分析
　　分別以鼠抗酵母表達(dá)蛋白rEmGam56多克隆抗體、鼠抗原核表達(dá)蛋白rEmGam56多克隆抗體和E.maxima雞康復(fù)血清為一抗，對酵母表達(dá)蛋白rEmGam56進(jìn)行Western-blot檢測，結(jié)果顯示該蛋白具有良好的免疫原性。以酵母表達(dá)蛋白rEmGam56為抗原，用間接

6、ELISA方法檢測鼠抗酵母表達(dá)蛋白rEmGam56多抗、原核表達(dá)蛋白rEmGam56多抗和雞康復(fù)血清，顯示該重組蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的抗體水平，并且能識別雞康復(fù)血清中的特異性抗體。
　　3.巨型艾美耳球蟲畢節(jié)酵母重組表達(dá)蛋白rEmGam56的免疫保護(hù)效果
　　以雛雞為試驗(yàn)動物，以死亡率、相對增重率、病變記分減少率與相對卵囊產(chǎn)量、細(xì)胞免疫和體液免疫水平等為評價指標(biāo)，對酵母表達(dá)蛋白rEmGam56的免疫保護(hù)效果進(jìn)行了初步研究，