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文檔簡(jiǎn)介
1、魚(yú)類(lèi)生活在一個(gè)水體環(huán)境,其大面積的黏膜是病原感染魚(yú)類(lèi)時(shí)最先接觸的部位,它們產(chǎn)生的黏膜免疫反應(yīng)是魚(yú)類(lèi)參與免疫應(yīng)答過(guò)程的一個(gè)重要組成部分。本研究通過(guò)人工灌注嗜水氣單胞菌,采用抑制性消減雜交(SSH)的方法構(gòu)建了草魚(yú)腸道組織差異表達(dá)消減cDNA文庫(kù),并對(duì)cDNA文庫(kù)克隆進(jìn)行了部分測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了同源性搜索和功能的分類(lèi)。同時(shí),對(duì)參與腸道組織免疫相關(guān)因子組織相容性復(fù)合物(MHC-Ⅱα)、Alpha-1-微球蛋白/bulinin前體蛋白基因的c
2、DNA全長(zhǎng)進(jìn)行克隆、序列分析,探討了它們?cè)诓蒴~(yú)不同組織中的表達(dá)分布。這些階段性研究為進(jìn)一步研究、闡釋魚(yú)類(lèi)黏膜免疫機(jī)制積累了重要材料。本文的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面: 1.消減cDNA文庫(kù)構(gòu)建及其序列分析 采用抑制性消減雜交技術(shù),構(gòu)建了草魚(yú)腸道組織在細(xì)菌誘導(dǎo)條件下和未誘導(dǎo)條件下,兩個(gè)不同生理狀態(tài)的消減cDNA文庫(kù),隨機(jī)挑取211個(gè)cDNA克隆進(jìn)行了單向測(cè)序,共獲得有效cDNA序列147個(gè)。 序列同源性搜索
3、結(jié)果顯示,在147個(gè)有效cDNA序列中,有97個(gè)克隆與GenBank中的已知功能序列具有較高的同源性,其中包含28條MHC類(lèi)EST序列;17個(gè)與未知功能的序列有一定的同源性;33個(gè)序列在Blast搜索中沒(méi)有找到任何對(duì)應(yīng)的相似序列,可能是沒(méi)有鑒定的EST。97個(gè)已知功能的EST分別屬于46個(gè)不同的基因。 根據(jù)Adams對(duì)功能基因的分類(lèi)方法,所獲得EST分為8類(lèi),蛋白質(zhì)與基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、代謝、細(xì)胞防御、細(xì)胞分裂和
4、其它未知功能的蛋白,在本實(shí)驗(yàn)獲得的EST分類(lèi),細(xì)胞防御類(lèi)cDNA序列所占比例最高,為序列總數(shù)的27.2%,其次為信號(hào)傳導(dǎo)和代謝,分別為12.9%、12.2%,蛋白質(zhì)與基因表達(dá)為11.6%。細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂兩者所占比例相對(duì)偏低,說(shuō)明在外源刺激的條件下,腸道組織細(xì)胞的防御、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、蛋白質(zhì)與基因表達(dá)相關(guān)因子都有一定的表達(dá)上調(diào),特別是與防御相關(guān)因子。 2.草魚(yú)腸道免疫相關(guān)基因MHC-Ⅱα的cDNA的克隆及序列分析
5、 根據(jù)草魚(yú)消減文庫(kù)獲得的EST序列(GenBank Acc No:EW688194)設(shè)計(jì)特異性引物,分別用5’-RACE和3’-RACE的方法獲得MHC-Ⅱα基因的全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank Acc No:EU186148)。采用生物信息學(xué)分析了MHC-Ⅱα基因cDNA序列的結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn),結(jié)果表明,所獲得的MHC-Ⅱα基因cDNA全長(zhǎng)為1007bp,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為717bp;可編碼238個(gè)氨基酸;5’非翻譯區(qū)34bp,3’非翻譯
6、區(qū)256bp;在nt962-967有一個(gè)AATAAA加尾信號(hào)。由MHC-Ⅱα基因cDNA推斷的氨基酸序列編碼蛋白的等電點(diǎn)為4.92,分子量為26.4KDa。在序列的前部分存在一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,在第210-232位存在一個(gè)跨膜區(qū)。氨基酸序列比較結(jié)果,草魚(yú)MHC-Ⅱα氨基酸序列與鯉魚(yú):MHC-Ⅱα相似性最高,其次為斑馬魚(yú),與比較的序列中的護(hù)士鯊相似性最低。系統(tǒng)進(jìn)化聚類(lèi)分析研究表明,草魚(yú)與鯉魚(yú)、斑馬魚(yú)進(jìn)化親緣關(guān)系最近,與護(hù)士鯊、
7、非洲鯛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。RT-PCR半定量分析組織中的表達(dá)分布,誘導(dǎo)后結(jié)果顯示,MHC-Ⅱα在脾臟、頭腎、后腸有較高的表達(dá),在肝臟表達(dá)較低,在肌肉中幾乎不表達(dá)。 3.草魚(yú)腸道組織免疫相關(guān)基因Alpha-1-microglobulling precursor,AMBP全長(zhǎng)cDNA克隆與序列分析 根據(jù)草魚(yú)消減cDNA文庫(kù)獲得的EST序列(Genbank Acc No:EW688152)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物,采用5’RACE和3’
8、RACE方法,經(jīng)拼接獲得AMBP基因全長(zhǎng)cDNA序列(Genbank Ace No:EU186151)。AMBP基因cDNA全長(zhǎng)序列為1230bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?047bp,可編碼348個(gè)氨基酸。cDNA序列組成上,在3’端存在2個(gè)不穩(wěn)定的信號(hào)ATTTA和一個(gè)加尾信號(hào)AATAAA。生物信息學(xué)方法對(duì)AMBP基因cDNA分析表明,AMBP編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6.27,分子量為38.84KDa。在AMBP中存在一個(gè)由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,
9、但沒(méi)有預(yù)測(cè)到跨膜區(qū)域。經(jīng)Swiss-Model預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)AMBP的空間結(jié)構(gòu)由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成,一個(gè)屬于lipocalin家族蛋白的α-1-微球蛋白,一個(gè)為胰蛋白酶抑制劑(Bikunin)。 經(jīng)Clustal W同源性序列比較發(fā)現(xiàn),AMBP氨基酸序列在相近物種中具有較高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)明顯分為二大支,草魚(yú)的AMBP與斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最近,其次是大西洋鮭魚(yú)和虹鱒,在進(jìn)化上它們共聚為一個(gè)大支,人、鼠、牛、豬它們?cè)谶M(jìn)化上相近,聚為一
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