馬鈴薯Y病毒NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb、CP基因介導(dǎo)的病毒抗性的比較研究.pdf

1、RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一種防衛(wèi)機制，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(PTGS)，一般由dsRNA引發(fā)。體外構(gòu)建的hpRNA可以高效地誘發(fā)基因沉默。一個病毒基因組編碼多種功能蛋白，不同的蛋白在病毒復(fù)制、增殖和傳播等過程中有著不同的功能，干擾不同基因表達可能誘發(fā)不同的基因沉默效果。 本研究以馬鈴薯Y病毒壞死株系(PVYN)的RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)方法，克隆了NIa-Vpg、NIa-Pro基因；進而

2、利用PCR擴增了NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb和CP等4個基因的3'端400bp和500bp片段，反向插入到雙元表達載體pROKII中，構(gòu)建了4個hpRNA結(jié)構(gòu)的植物表達載體。通過根癌農(nóng)桿菌(LBA4404)介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草NC89，經(jīng)卡那霉素抗性篩選、PCR檢測，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。大分子RNA和siRNA的Northernblot分析表明，目的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累量與植株的抗病性呈負相關(guān)，可檢測到siRNA，證明所獲得的抗病性

3、是RNA介導(dǎo)的抗病性。研究結(jié)果對于將來有效地選擇靶位點序列和成功應(yīng)用RNA介導(dǎo)的病毒抗性策略提供依據(jù)，具有重大指導(dǎo)意義。具體結(jié)果如下： 1.利用RT-PCR技術(shù)，分別克隆PVYN的NIa-Vpg、NIa-Pro基因；進而利用PCR擴增了NIa-Vpg、NIa-Pro和NIb、CP(由實驗室前期克隆)等4個基因3'端的400bp和500bp片段，分別插入到雙元表達載體pROKII中，構(gòu)建莖長度為400bp，環(huán)長度100bp的發(fā)夾結(jié)

4、構(gòu)的植物表達載體pROKII-NIa-Vpg、pROKII-NIa-Pro、pROKII-NIb、pROKII-CP。 2.將所構(gòu)建的植物表達載體pROKII-NIa-Vpg、pROKII-NIa-Pro、pROKII-NIb、pROKII-CP及空pROKII利用凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明質(zhì)粒均已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株。 3.葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。經(jīng)卡那霉素對再生植株再次抗性篩選、PCR

5、檢測，共獲得轉(zhuǎn)pROKII的煙草34株，轉(zhuǎn)NIa-Vpg的煙草126株，轉(zhuǎn)NIa-Pro的煙草101株，轉(zhuǎn)NIb的煙草100株，轉(zhuǎn)CP的煙草132株。 4.以PVYN的病汁液為接種物，汁液摩擦接種轉(zhuǎn)基因煙草，對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗病性分析。癥狀觀察及ELISA檢測表明不同的轉(zhuǎn)基因植株對PVYN的抗性存在著差異。在126株轉(zhuǎn)NIa-Vpg的T0代煙草中，有82株表現(xiàn)高度抗病，抗性植株比例為65.08％；101株轉(zhuǎn)NIa-Pro的T0

6、代煙草中，有59株表現(xiàn)高度抗病，抗性植株比例為58.42％；100株轉(zhuǎn)NIb的T0代煙草中，有43株表現(xiàn)高度抗病，抗性植株比例為43.00％；132株轉(zhuǎn)CP的T0代煙草中，有84株表現(xiàn)高度抗病，抗性植株比例為63.64％。 5.轉(zhuǎn)基因植株的Northernblot分析表明，轉(zhuǎn)基因都在RNA水平上得到了表達，抗病性與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累量二者呈負相關(guān)，即這種抗病性為RNA介導(dǎo)的抗病性，是RNA沉默的結(jié)果。 6.轉(zhuǎn)基因植株s